用于生物系统中离子浓度检测的荧光纳米颗粒

摘要

我们实验室制备的荧光纳米颗粒可用于成像生物系统中的离子浓度和离子流，例如细胞在信号传导过程中以及生理稳态下间质液中的离子动态。

摘要

全身范围内严格调控的离子稳态对于预防脱水等衰弱状态至关重要。¹ 相比之下，可兴奋细胞产生动作电位需要细胞水平上的快速离子流。² 钠的调节在上述两种情况下均起着重要作用；然而，目前尚无能够持续监测钠水平的方法 体内 ³ 细胞内钠离子探针 ⁴ 无法提供与钙离子探针类似的详细结果。为了弥补这两方面的不足，已开发出可监测钠离子浓度的荧光纳米传感器 体外 和 体内.^5,6 这些传感器基于离子选择性光极技术，由增塑聚合物颗粒构成，其中嵌入了钠特异性识别元件、pH敏感型荧光染料以及添加剂。^7-9 从机制上讲，钠识别元件将钠离子富集到传感器中。 ¹⁰ 这种提取会导致pH敏感型荧光团释放一个氢离子，以维持传感器内部的电荷中性，从而引起荧光变化。钠离子传感器具有可逆性，并且对钠离子的选择性高于钾离子，即使在高浓度细胞内钾离子存在的情况下也是如此。⁶ 它们直径约为120 nm，表面包被聚乙二醇以赋予生物相容性。利用显微注射技术，可将这些传感器递送至细胞胞质中，已证明其能够监测搏动心肌细胞中钠离子的时间和空间动态变化。¹¹ 此外，他们还追踪了钠离子浓度的实时变化 体内 当皮下注射到小鼠体内时。³ 本文详细阐述并演示了荧光钠纳米传感器的制备方法，并简要展示了本实验室所采用的生物应用：将传感器显微注射至细胞内，以及将传感器皮下注射至小鼠体内。

方案

1. 光学传感器的制备

在制备光学传感器之前，需要分装各组分，以便于准确量取和储存。

1. 将一个50 mg的钠离子载体X（NaIX）小瓶和一个50 mg的四[3,5-双(三氟甲基)苯基]硼酸钠（NaTFPB）小瓶分别用四氢呋喃（THF）溶解，并分装至1.5 ml聚苯乙烯离心管中。在化学通风橱中，将50 mg NaIX溶于1 ml THF中（在原装小瓶内），混匀以确保固体完全溶解。将该溶液100 μl转移至10个独立的离心管中。对NaTFPB重复相同操作。在化学通风橱中过夜挥发THF，标记离心管，并将其置于4摄氏度冰箱中保存。由此可得到每份5 mg的干燥NaIX和NaTFPB分装样品。
2. 将显色离子载体III（CHIII）溶于1 ml THF中，并转移至一个3 ml玻璃小瓶中。向CHIII原装小瓶中再加入1 ml THF，以溶解残留的CHIII，并将此溶液一并加入3 ml玻璃小瓶中。总体积现为2 ml。将CHIII的THF溶液各1 ml分别转移至两个带聚四氟乙烯涂层瓶盖的1.5 ml玻璃小瓶中。将CHIII溶液以5 mg/ml的终浓度保存于4摄氏度冰箱中。

这些等分试样和溶液将用于制备光学传感器材料。

3. 移液66 μ将1毫升的癸二酸二(2-乙基己基)酯（DOS）加入至一个带有聚四氟乙烯涂层螺旋盖的1.5毫升玻璃小瓶中——此即为光学传感器小瓶。DOS为黏稠溶液，因此需小心操作以确保准确转移所需体积的溶液。该体积对应于 ˜ 60 mg 的 DOS。
4. 称取30 mg高分子量聚氯乙烯（PVC），并转移至光纤传感器小瓶中。
5. 现在将分装好的功能组分加入光学传感器小瓶中，以制备所需光学传感器。CHIII、NaIX 和 NaTFPB 的相对浓度将决定传感器对钠离子的响应特性。可通过调整这些浓度，使传感器理想地响应细胞内钠浓度（Kd 为 10 mM）或细胞外钠浓度（Kd 为 150 mM）。此外，供应商提供的化学试剂可能存在批次间差异，因此有必要对每批新到的化学组分所制备的传感器进行校准，以确认其响应是否符合预期。本文所述方法用于制备通常适用于细胞内钠离子检测的传感器浓度。
6. 在化学通风橱中，转移100 μ向传感瓶中加入1毫升5 mg/ml的CHIII THF溶液。
7. 将5 mg NaIX溶解于300 μ毫升 THF 并转移 300 μ加入到光学传感器小瓶中的量相当于5 mg的NaIX。
8. 将5 mg NaTFPB样品溶解于500 μl 的 THF 并转移 20 μ向氧敏瓶中加入该溶液 l，相当于 0.1 mg 的 NaTFPB。
9. 加入80 μ向氧传感小瓶中加入 THF。
10. 光敏瓶中的溶液含有 30 mg PVC、60 mg DOS、5 mg NaIX、0.2 mg NaTFPB、0.5 mg CHIII，溶于 500 μl 的 THF。轻轻涡旋该小瓶，直至所有 PVC 完全溶解。感应膜应呈红色。加入小瓶中的 THF 总体积应为 500 μL，无论所用组分的比例如何。
11. 让 NaIX 和 NaTFPB 等分试样中残留的 THF 过夜挥发，并重新标记试管上化学品的准确用量。

2. 构建纳米传感器

1. 移液100 μ10 mg/ml 1,2-二硬脂酰基-sn将氯仿中的甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-550]（PEG-脂质）加入4 dram玻璃小瓶中。在化学通风橱中使氯仿挥发。可通过氮气或压缩空气吹干加速干燥过程。
2. 向含有PEG-脂质的小瓶中加入4 ml所需水溶液。将小瓶置于超声探头下方的实验室升降台上，抬升小瓶直至探头深入溶液约7 mm处，在低功率条件下超声处理30秒。此处我们使用Branson数字超声仪，设定振幅为15%，配备一个 ½ 英寸尖端直径阶梯式变幅杆。水溶液可以是任意溶液。例如，为了测定传感器的响应，我们使用含三羟甲基氨基甲烷碱的10 mM HEPES（pH 7.2）溶液。
3. 在溶液超声处理的同时，混合50 μ50微升的氧敏材料 μ在0.6 ml微量离心管中加入l毫升二氯甲烷。用移液器混合以确保均匀。
4. 将超声仪调节至超声处理3分钟。启动超声处理，同时在超声过程中将移液枪尖浸入溶液，将100 μL的氧探针混合溶液加入小瓶中 μ快速、均匀地注入1升溶液。根据所用的水溶液，溶液应变为蓝色。
5. 超声处理继续约30秒，然后降低升降架，使超声探头尖端浸入溶液深度约为2 mm。此时溶液应开始产生气泡，逐渐变得浑浊。此步骤有助于去除溶液中残留的四氢呋喃和二氯甲烷。
6. 超声处理完成后，将纳米传感器溶液吸入一支5 ml注射器中。安装一个0.2 μ使用 m 规格注射器滤器将纳米传感器溶液过滤并分装至带螺口盖的玻璃小瓶中。若所用为含钠浓度低于 10 mM 且 pH 值低于约 9 的水溶液，则溶液应呈清澈蓝色；否则，溶液应无色或呈粉红色。

3. 确定纳米传感器响应

该方法用于测定设计用于测量细胞内钠的纳米传感器的响应。建议对细胞外钠浓度纳米传感器使用不同浓度。

1. 在10 mM HEPES（1 M Na）中配制10 mM HEPES（0 Na）和1 M氯化钠（NaCl）的储备液，并使用三（羟甲基）氨基甲烷碱（trizma base）将各溶液的pH调节至7.2。在50 ml锥形离心管中混合0 Na和1 M Na的储备液，配制出NaCl浓度分别为0、1、5、10、20、50、100、200、500、1000 mM的系列溶液。
2. 使用光学底96孔板测定响应。将每种钠浓度溶液各100 μl加入一列中的3个孔中，形成3 × 10孔的阵列。
3. 向每个孔中加入100 μl新鲜配制的纳米传感器溶液，并将板放入微孔板荧光仪中。我们使用Molecular Devices Spectramax M3仪器。
4. 使用以下波长读取每个孔：

激发 (nm)	发射 (nm)	截止 (nm)
488	570	530
488	670	610
639	680	665

每个波长下的纳米传感器信号强度依赖于钠离子浓度。波长的选择取决于具体应用。对于细胞内缓慢动态变化的测量，我们使用488 nm/570 nm（激发/发射）和488 nm/670 nm，这使得我们能够对两个波长的信号进行比值计算，从而降低噪声。

5. 传统上，将光极数据转换为 α 值：α = (I - I_min)/(I_max - I_min)，其中 I 为给定钠离子浓度下的荧光强度，I_min 为响应测量中的最低强度，I_max 为响应测量中的最高强度。将 570 nm 处的强度与 670 nm 处的强度的比值，或 680 nm 处的强度转换为 α 值。
6. 使用绘图软件（本实验室通常使用 Excel 或 Origin），以 α 值对钠离子浓度的对数作图，将零钠浓度的对数值设为 -1。对响应曲线拟合一条S形曲线，并从该曲线计算 α = 0.5 时对应的钠离子浓度，该浓度即为传感器响应最佳的浓度。
7. 调整光极中 CHIII、NaIX 和 NaTFPB 的比例，以制备在目标钠离子浓度附近具有最佳响应的纳米传感器。

4. 细胞内成像

1. 进行细胞内测量时，需将纳米传感器制备于5 mg/ml的葡萄糖水溶液中，并通过显微注射将其注入细胞内。
2. 将细胞培养或转移至底部为玻璃的培养皿或带有玻璃盖玻片底部的成像腔室中。
3. 将细胞孵育在透明培养基或Tyrode's溶液中，然后将成像腔室或培养皿安装到落射荧光显微镜上。我们使用的是蔡司LSM 7共聚焦显微镜。
4. 使用拉针仪将毛细玻璃管拉制成针尖。我们采用Sutter Flaming Brown P-97拉针仪，配合外径1 mm、内径0.78 mm的玻璃管，最终拉制出针尖直径约为300–500 nm的微针。
5. 使用注射器配合Hamilton针头，或使用微载样头和移液器，从针尖后端填充纳米传感器溶液。
6. 将微针安装至连接在显微操作仪上的针夹中，并接入压力控制注射系统。本实验中使用的是Burleigh EXFO PCS 6000显微操作仪和Medical Systems Corporation注射器。
7. 将微针下移至细胞表面并穿入细胞质，有时需要轻“敲”操作仪支架以穿透细胞膜。注入纳米传感器溶液后，迅速撤出微针。

5. 体内成像

所有实验程序均已通过东北大学动物护理与使用委员会的审查和批准。

1. 纳米传感器用于 体内在磷酸盐缓冲盐水中进行细胞外成像，并调整至在135 mM钠浓度下对钠产生最佳响应。
2. 对于小鼠体内荧光纳米传感器的注射设置及成像，我们使用 IVIS Lumina II 及其配套的麻醉设备。对诱导麻醉室和成像室进行消毒。将 CD1 裸鼠（约 20 g）放入诱导麻醉室，并暴露于异氟烷中。 异氟烷浓度及氧气流速的设置需根据小鼠的品系和体重进行调整。 等待小鼠完全麻醉。
3. 小鼠麻醉后，将其从诱导室中取出并放入成像室，保持麻醉状态。对每只小鼠，消毒预定的注射部位。
4. 用无菌31G胰岛素注射器吸取10 μ确保去除所有气泡后，加入纳米传感器溶液。
5. 用镊子夹住小鼠背部预定注射部位的一小褶皮肤。夹住皮肤的同时，将针头斜面向上、针头与皮肤平行刺入皮肤。
6. 在注射传感器之前，回拉注射器活塞，确保针头未插入血管内。然后，轻轻左右移动针头，在皮下形成一个囊袋。这将最大限度地减少回压，防止传感器从注射部位渗出。注射传感器后，轻柔地拔出注射器。
7. 轻轻按压注射部位，并擦去可能从注射部位渗出的溶液，以尽量减少未注入皮肤的传感器产生的荧光。
8. 重复步骤 5.4 至 5.7，直至达到所需的注射区域数量。建议在背部左右两侧各选择六个注射位点，均匀分布。每只小鼠若针头插入皮肤困难，应更换针头。 针头不得在小鼠之间共用。 这将最大限度地减少小鼠之间的疾病传播或交叉污染。
9. 为成像钠离子荧光传感器，我们使用滤光片组同时获取小鼠的明场和荧光图像，该滤光片组的参数最接近纳米传感器的640 nm/680 nm（激发/发射）光谱，并可最大程度减少皮肤自发荧光。

6. 代表性结果

图1. 五种不同纳米传感器组对钠的响应曲线。每组代表来自不同光学传感器配方的纳米传感器，这些传感器含有相同量的CHIII、NaTFPB、PVC和DOS，但NaIX的含量不同。数据通过639/680 nm处的荧光强度转换为α值。数据为3次重复的平均值，为清晰起见省略了误差线，并使用Origin软件拟合了S型曲线。在此响应曲线中，所用钠的最高浓度为500 mM。钠纳米传感器对钠的Kd值范围从10 mM（橙色菱形）到约150 mM（黑色方块）。

图2. 显微注射新生大鼠心肌细胞。细胞培养在盖玻片上，置于显微镜下并注射钠离子纳米传感器。图中显示荧光图像（639 nm激发）、明场图像及两者的叠加图像。注意可见部分传感器出现聚集现象，但细胞形态正常，传感器已扩散至整个细胞质，且未见细胞核染色。

图3. 小鼠皮下注射钠纳米传感器。将九种不同的钠纳米传感器注射至裸鼠的皮下组织。图像叠加了明场与荧光（640/680）成像结果。

讨论

一旦指示剂溶液配制完成且PEG脂质干燥后，纳米传感器的形成不应超过10分钟。指示剂不仅可在需要时快速制备，而且在4摄氏度下储存时可保持数月稳定。我们已证明，纳米传感器一旦形成，在溶液中至少可稳定保持一周；然而，必须注意防止在此期间发生光漂白，应将纳米传感器避光保存⁶。尽管本文展示的是钠离子纳米传感器，但指示剂已被用于检测大多数生物学相关的离子，如钾离子和氯离子^10,12。我们还已将该技术扩展至葡萄糖等小分子的检测¹³。

除了制备用于监测不同分析物的纳米传感器外，这些纳米传感器还可进行多种改造，使其适用于绝大多数生物学实验。例如，本例中的表面涂层（聚乙二醇）可通过使用任何水溶性两亲分子轻松替换。这使得纳米颗粒能够针对不同应用或靶标进行功能化修饰。此外，通过改变表面涂层、超声处理强度或所用溶剂，也可调节纳米颗粒的尺寸。

钙离子荧光指示剂在确定细胞内钙信号传导方面具有不可估量的价值；然而，目前尚无可用的钠离子敏感染料具备类似的理想特性。旨在为细胞内离子成像提供替代方法的光导纳米颗粒已研发多年¹⁴。我们在先前研究的基础上，开发出专用于细胞内钠离子成像的纳米传感器，有望为理解钠离子信号如何影响细胞功能，以及信号异常如何导致某些疾病提供有效手段。

荧光纳米传感器的应用 体内 为监测分析物提供了一种实时、微创的替代方法，相较于抽血等其他方法更具优势。³ 基于上述技术的钠离子和葡萄糖纳米传感器已被证明可分别追踪钠和葡萄糖的变化 体内.^3,13 然而，该方法作为监测工具目前仍存在一些局限性。例如，传感器必须包含一种荧光团，其光谱需充分向近红外红区偏移，以尽量减少皮肤背景自体荧光的干扰。¹⁵ 其次，目前的注射技术无法实现纳米传感器的均匀注射，这可能是由于注射深度不一致等误差所致。尽管存在这些局限性，此类荧光纳米传感器的开发及其成功验证有望使其成为监测患者健康状况的宝贵研究工具与方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IVIS Lumina II 仪器套装	Caliper Life Sciences	126273
CD-1裸鼠	查尔斯河实验室	品系编号：086	免疫缺陷
胰岛素注射器	BD 生物科学	328438	3/10 ccmL ，8毫米，31G
高分子量PVC	Sigma-Aldrich
DOS	Sigma-Aldrich
CHIII	Sigma-Aldrich
NaTFPB	Sigma-Aldrich
NaIX	Sigma-Aldrich
薄壁毛细玻璃管	Sutter Instrument Co.
PEG脂质	Avanti Polar Lipid, Inc
<强>表1. 提供本实验所用化学品和设备的清单。未列出的常见化学品均购自 Sigma。