KISS1R（kisspeptin 受体）的突变与患者的生殖系统疾病相关。本文介绍了如何在 KISS1R 的 GC 富集序列中引入目标突变，以及如何利用 KISS1R 重组质粒通过免疫共沉淀和蛋白质印迹技术来表征该受体的降解途径。
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摘要
摘要
吻肽受体（KISS1R）是一种G蛋白偶联受体，被认为是启动青春期以及调节成年期生殖能力的关键因子1,2,3。在患者中发现的KISS1R失活突变与特发性低促性腺激素性性腺功能减退症（IHH）1,2以及性早熟4相关。对这些突变体的功能研究对于理解该受体调控生殖的机制以及由异常的KISS1R信号传导和功能所导致的疾病表型至关重要。然而，KISS1R基因高度富含GC碱基的序列使得通过PCR引入突变或扩增编码该受体的基因变得相当困难。
本文介绍了一种将目标突变引入该高GC含量序列的方法，该方法已在我们的实验室成功用于构建十余种KISS1R突变体。我们优化了PCR条件，以促进扩增多种包含KISS1R序列中氨基酸替换、缺失或插入的KISS1R突变体。添加PCR增强剂溶液以及少量DMSO对改善扩增效果尤为有帮助。该优化后的实验流程也可能适用于其他高GC含量的模板。
编码KISS1R的表达载体已被用于表征该受体的信号转导及其功能，以阐明突变如何改变KISS1R功能并导致相关的生殖表型。因此，通过定点诱变生成的KISS1R突变体的潜在应用已在多项研究中得到证实1,4,5,6,7,8。例如，与性早熟相关的KISS1R功能获得性突变（Arg386Pro）已被证明可延长受体对配体刺激的反应时间4，并改变KISS1R的降解速率9。有趣的是，我们的研究表明，KISS1R通过蛋白酶体途径降解，而非大多数G蛋白偶联受体所典型的溶酶体降解途径9。在本示例中，通过瞬时表达Myc标签标记的KISS1R（MycKISS1R）并用蛋白酶体或溶酶体抑制剂处理的人胚肾细胞（HEK-293）来研究KISS1R的降解情况。细胞裂解物使用与琼脂糖偶联的抗Myc抗体进行免疫沉淀，随后进行蛋白质印迹分析。利用LI-COR Odyssey红外成像系统对印迹膜上的MycKISS1R进行检测和定量。该方法也可适用于其他目标蛋白降解过程的研究。
方案
1. 高GC含量的KISS1R基因序列的定点突变
- 模板：人源 KISS1R 的全长 cDNA 序列，其 N 末端融合有 Myc 标签。该序列被克隆至 pCS2+ 表达载体中，该载体适用于后续转染所用的哺乳动物细胞系。本文中将该表达载体称为 pCS2+MycKISS1R。
- 引物设计：根据 Quikchange 定点突变试剂盒（Stratagene）的说明书设计携带目标突变的引物。简要如下：
- 两条引物（正向与反向）均需包含目标突变，并分别与质粒双链上相对应的序列退火（例如，正向与反向引物彼此互补）
- 引物长度应为 25 至 45 个碱基，且末端应包含一个或多个 C 或 G 碱基
- 引入的突变应位于引物中央，并在其两侧各被约 10–15 个正确序列的碱基所包围
- 引物的熔解温度（Tm）应等于或高于 78°C。使用以下公式估算 Tm：
- 引入点突变时：Tm = 81.5 + 0.41(%GC) – 675/N – % mismatch（N 为引物碱基数）
- 引入插入或缺失突变时：Tm = 81.5 + 0.41(%GC) – 675/N（N 不包括被插入或删除的碱基）
- 使用脱盐纯化的引物（无需进一步纯化）。
- 两条引物（正向与反向）均需包含目标突变，并分别与质粒双链上相对应的序列退火（例如，正向与反向引物彼此互补）
- 最佳扩增条件包括添加 PCRx 增强溶液（Invitrogen）和 DMSO。应至少测试两种 DMSO 浓度，如 4% 和 8%。PCR 反应条件见表 I 和图 1；pCS2+MycKISS1R 的代表性 PCR 扩增结果见图 2。
- 通过 DpnI 酶切甲基化 DNA 以去除亲本质粒 DNA：在离心管中混合 17.5μl PCR 产物、2μl 10x NEBuffer 4 和 0.5μl DpnI（10U；New England Biolabs），37°C 孵育 1 小时 30 分钟。
- 转化经 DpnI 处理的 PCR 产物：将 2μl DpnI 处理后的 DNA 与 45μl 预冷的 XL10-Gold 超感受态 E. coli（Stratagene）混合于预冷的 15 ml 细胞培养管中。加入 2μl β-巯基乙醇，并按照 Stratagene 提供的操作说明进行后续步骤。取 100–400μl 转化后的菌液涂布于含 100μg/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板，37°C 培养。
- 挑取 2 至 4 个单克隆进行质粒小提，以分离质粒 DNA。通过测序及序列分析确认目标突变是否成功引入。
2. 将 MycKISS1R 瞬时转染至 HEK-293 细胞
- 以下实验在培养于CO₂培养箱中的人胚肾细胞（HEK-293）中进行2 培养箱（5% CO₂）2在 37°C 在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM中。
- 将HEK-293细胞以2.5×10⁵接种5 细胞/ml 接种于6孔板中，于37℃培养过夜 37°C 转染前。注意：（i）每种实验条件设三个复孔；（ii）转染时理想的细胞汇合度为30%–50%。
- 使用GenePorter转染试剂（Genlantis），按照制造商说明书转染HEK-293细胞：将一半量的无血清DMEM与 0.5μg pCS2+ MycKISS1R 质粒 0.5μg 对照（空）载体至总体 1μg 每孔 DNA 量。将另一半与 10μl 转染试剂每 μg 转染的DNA量。注意：理想的质粒DNA浓度可能有所不同。
3. 细胞处理与裂解
- 转染后24小时，将细胞培养基更换为含2.5% FBS的1ml DMEM（以降低细胞代谢）。注意：血清浓度的降低可能有助于增强或放大结果的检测。
- 将溶酶体抑制剂（每孔100μg亮抑蛋白酶肽）直接加入一个完整的6孔板的每孔中。在37°C下孵育6或16小时（或其他所需时间）。
- 将新鲜配制的蛋白酶体抑制剂（每孔10μM MG132）直接加入两个完整6孔板的所有孔中。在37°C下孵育2、4、6或16小时（或所需时间）。向第四个6孔板的所有孔中加入等量溶剂（0时间点），并在37°C下孵育16小时。
- 孵育结束后，将培养板置于冰上，并在整个裂解过程中保持低温，以防止蛋白质降解：
- 为提高蛋白质得率，将6孔板中的三个重复样本合并至同一离心管中
- 吸除培养基，并用1ml预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次
- 向每孔加入100μl预冷的裂解缓冲液（20mM HEPES，pH 7.4，1% NP-40，150mM NaCl，1mM EDTA，0.25% 脱氧胆酸钠），其中含有蛋白酶抑制剂（1×混合液，包含100mM AEBSF-HCl、80μM抑肽酶、5mM Bestatin、1.5mM E-64、0.5M EDTA、2mM亮抑蛋白酶肽和1mM胃蛋白酶抑制剂A，另加2mM PMSF）
- 用细胞刮刀刮下细胞，并将细胞裂解物转移至离心管中
- 用20号针头反复吹打细胞约10次。注意：用于膜蛋白Western blot检测的样品切勿进行超声处理。超声会导致膜蛋白聚集，从而在电泳过程中无法正常迁移
- 将细胞裂解物在4°C下于摇床上孵育1小时
- 在4°C下以10,000 × rpm离心10分钟，将上清液转移至新管中。注意：此步骤中切勿扰动沉淀物
- 使用BCA法（Pierce）测定10μl上清液中的蛋白质浓度
- 用含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液将裂解物稀释至1mg/ml。
4. MycKISS1R 的免疫沉淀与蛋白质印迹检测
- 在冰上（或4°C）进行以下免疫沉淀步骤：
- 用预冷的PBS缓冲液将适量的琼脂糖偶联抗myc抗体（每样品2.5μg）洗涤两次，然后加入到含有400μg裂解液蛋白的样品中。
- 在4°C下，于摇床上轻柔振荡条件下，对裂解液中的MycKISS1R进行过夜免疫沉淀。
- 在4°C下通过瞬时离心沉淀琼脂糖珠（最高可达10,000 × rpm）。
- 吸除并弃去上清液（注意不要扰动沉淀）。
- 用预冷的裂解缓冲液洗涤珠子一次，再用预冷的PBS洗涤两次。离心前轻轻倒置离心管混匀。
- 将含有抗体结合的MycKISS1R的珠子重悬于含10% β-巯基乙醇的2×上样缓冲液中。
- MycKISS1R免疫复合物的Western印迹检测：
- 在37°C加热样品30分钟。 注意： 用于膜蛋白Western印迹检测的样品切勿煮沸。与超声处理类似，煮沸也会导致这些蛋白发生聚集。
- 立即将离心管转移至冰上冷却5分钟。
- 在4–15%的梯度凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白。
- 使用Bio-Rad半干转印装置，在转膜缓冲液（48 mM Tris碱，39 mM甘氨酸，1.2 mM SDS，20%甲醇，pH 9.2）中以25 V电压转印30分钟，将蛋白转移至Immobilon-FL PVDF膜（适用于红外检测）。
- 室温下用Tris缓冲盐水（TBS）洗涤膜5分钟，并在摇床上用Licor Odyssey封闭液封闭1小时（也可选用含5%脱脂奶粉的TBS封闭非特异性结合位点）。
- 在含0.1% Tween-20的封闭液中，于4°C与兔抗myc抗体（1:500稀释）孵育过夜。
- 去除一抗后，用含0.1% Tween-20的TBS（TBST）洗涤膜3次，每次5分钟。
- 在含0.1% Tween-20和0.01% SDS的封闭缓冲液中，室温下与山羊抗兔IgG红外染料® 800CW标记二抗（1:10,000稀释）孵育1小时。
- 去除二抗后，用TBST洗涤膜3次，每次5分钟，最后再用TBS洗涤一次（以去除残留的Tween-20）。
- 使用LI-COR Odyssey红外成像系统对MycKISS1R进行成像与定量分析：
- 将膜置于Odyssey扫描仪的左下角，与网格对齐。覆盖橡胶垫，用滚筒压平气泡，然后关闭盖子。
- 在计算机上创建新的项目文件。命名文件，点击“完成”，然后在“扫描”界面输入扫描仪登录信息。调整扫描窗口大小以适配膜的尺寸，选择169μm分辨率和中等图像质量。
- 根据各信号预期强度，设置700（红色）和800（绿色）通道的强度参数。此设置仅用于信号可视化，不影响定量结果。点击“开始扫描”。
- 命名并保存扫描图像，然后点击“确定”在新窗口中打开图像进行定量分析。MycKISS1R单体应在约43kD处可见。
- 使用左侧工具栏中的“方框”工具，在第一个条带周围绘制方框。移动方框确保所有条带均被包含，然后“复制”并“粘贴”该方框至所有其他条带位置。
- 使用“Ctrl+A”选中所有方框，然后选择“扣除中值背景”选项。点击顶部菜单中的“报告”，将弹出包含定量数值的电子表格。此处展示的代表性结果以未处理细胞（零时间点）为对照，表示为倍数变化。
5. 代表性结果：
- 针对高GC含量的KISS1R基因序列进行定点突变：
表1. 显示了用于提高KISS1R扩增效率的试剂组合。该组合已成功用于在KISS1R cDNA序列的不同区域引入多个突变，同时也适用于这一高GC含量基因的扩增。图1展示了KISS1R定点突变的循环及扩增条件。这些条件是在QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）的基础上进行优化而得。
图2. 展示了使用该优化方案获得的代表性结果。添加4%或8% DMSO并联合使用PCRx增强剂，可显著提高含高GC含量KISS1R cDNA质粒的扩增产量。在此代表性实验中，4% DMSO提供的扩增效果略优于8% DMSO。将经DpnI处理的扩增产物转化至超感受态E. coli后，通常可获得100至超过1,000个菌落，DNA测序结果显示目标突变的成功引入率为80–90%。 - 利用MycKISS1R构建体研究受体生理功能：
在此代表性实验中，采用本方案优化后扩增得到的野生型pCS2+MycKISS1R，用于研究在 transient 表达MycKISS1R的相关细胞系（HEK-293）中体内 KISS1受体的降解情况。根据方法部分所述方案，对转染后的HEK-293细胞分别使用溶酶体抑制剂（亮抑酶肽）或蛋白酶体抑制剂（MG132）处理后，裂解细胞并进行Western印迹分析。图3的上图显示了MycKISS1R单体的扫描结果，下图则为上图条带的定量分析。条带定量结果表明，无论是6小时还是16小时的亮抑酶肽处理，均未影响MycKISS1R蛋白水平。相反，MG132处理导致该细胞中MycKISS1R蛋白呈时间依赖性增加，在加入MG132孵育16小时后，受体积累量达到原来的45倍。这些结果表明，与大多数G蛋白偶联受体不同，KISS1R主要通过蛋白酶体途径（而非溶酶体途径）被降解。
| DMSO | |||
| 试剂 | 0 | 4% | 8% |
| 水 | 35 | 33 | 31 |
| 10x Pfu Ultra Taq 缓冲液 | 5 | 5 | 5 |
| dNTP 混合液 (10mM) | 1 | 1 | 1 |
| 正向引物 (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| 反向引物 (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| 10x PCRx 增强溶液 | 5 | 5 | 5 |
| DMSO | 0 | 2 | 4 |
| Pfu Ultra Taq 聚合酶 (2.5U/μl) | 1 | 1 | 1 |
| 质粒 DNA (20ng/μl) | 1 | 1 | 1 |
表1. 成功用于突变和扩增富含GC的KISS1R的试剂组合
图1. GC富集区KISS1R成功定点突变与扩增的循环条件： 先进行2分钟热启动，随后进行18个循环，每个循环包括95°C下30秒变性、55°C下1分钟退火以及68°C下6分钟延伸。在最后一个循环结束后，额外增加一次68°C下10分钟的延伸步骤。上述程序是在QuikChange II XL定点突变试剂盒（Stratagene）原始突变方案基础上优化调整而得。
图2. 在有或无DMSO存在条件下扩增GC含量丰富的pCS2+MycKISS1R： 将在含0%、4%或8% DMSO条件下扩增的pCS2+MycKISS1R各5 µl上样至本代表性1%琼脂糖凝胶，经溴化乙锭染色后使用紫外光成像。在含4%和8% DMSO条件下扩增的PCR产物泳道中均可见约6 Kb的质粒条带，而第一泳道（无DMSO条件下扩增的PCR产物）中未见明显条带。
图3. 亮抑蛋白酶肽或MG132对Myc水平的影响KISS1R HEK-293细胞中的蛋白质： 表达Myc的HEK-293细胞KISS1R 用……处理 100μg/ml 亮抑蛋白酶肽或 10μM MG132 在 37°C 指定时间。MycKISS1R 在 400μg 细胞裂解液进行免疫沉淀 2.5μg Myc的琼脂糖偶联抗myc抗体免疫沉淀及Western印迹分析。（A）LI-COR Odyssey检测MycKISS1R 孵育免疫印迹膜与兔抗Myc标签抗体，随后孵育IRDye 800CW标记的抗兔抗体；（B）Myc的定量分析KISS1R 使用LI-COR Odyssey定量软件对(A)中所示条带进行分析。结果以未处理细胞（0时间点）的倍数变化表示。
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讨论
定点突变技术已被用于研究蛋白质功能，通过在靶向基因的编码序列中引入核苷酸改变，已有三十多年的历史。该技术最初由英裔加拿大化学家、诺贝尔奖得主迈克尔·史密斯（Michael Smith）于1978年提出10。迈克尔·史密斯与发明聚合酶链式反应（PCR）的美国生物化学家凯利·穆利斯（Kary Mullis）共同获得了1993年诺贝尔化学奖11。自迈克尔·史密斯首次描述该方法以来，该技术经过多年不断改进。如今，可在单次PCR反应中向目标基因序列引入突变、插入或缺失，这不仅显著提高了该方法的准确性和成功率，也使得突变体能够在相对较短的时间内被高效构建。
尽管技术不断进步，对富含GC的基因序列（如KISS1R）进行突变和扩增仍然特别困难。KISS1R基因某些区域的GC含量超过85%。为对高GC含量序列进行定点突变而设计的引物，其长度必须根据GC含量进行调整，以确保熔解温度处于推荐范围内。因此，用于在KISS1R中引入突变的引物应设计为熔解温度在78°C至86°C之间。针对这些高GC区域设计的引物...
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致谢
本工作部分由美国国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD – R21 HD059015）生殖分支以及查尔斯·H·胡德基金会青年研究者儿童健康研究奖（马萨诸塞州波士顿）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x PCRx 增强溶液 | Invitrogen | 52391 | |
| PfuUltra 高保真 DNA 聚合酶替代去垢剂 | Stratagene, Agilent Technologies | 600385 | |
| Dpn-I | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | R0176 | |
| XL10-Gold 超感受态 E. coli 细胞 | Stratagene, Agilent Technologies | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Geneporter 转染试剂 | Genlantis | T201007 | |
| 亮抑蛋白酶肽（Leupeptin） | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47491 | |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物及 PMSF | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24948 | |
| Pierce BCA 蛋白定量试剂盒 | 赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.） | 23225 | |
| 抗 Myc 标签（克隆 4A6）琼脂糖偶联物 | EMD Millipore | 16-219 | |
| 2x 上样缓冲液 | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Criterion Tris-HCl 预制胶，4–15% 浓度梯度 | Bio-Rad | 345-0028 | |
| Immobilon-FL PVDF 膜 | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Odyssey 封闭缓冲液 | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 兔抗 myc 抗体 | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| IRDye 800CW 标记山羊抗兔二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Odyssey 成像红外系统 | LI-COR Biosciences | ||
| Halt 蛋白酶抑制剂混合物（100x） | 赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.） | 78430 |
参考文献
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