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无试剂检测核酸、蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备

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DOI：

10.3791/2922

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2011年6月1日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University Of California Santa Barbara, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Program in BioMolecular Science and Engineering, University Of California Santa Barbara

本文内容

摘要

“E-DNA”传感器是一种无需试剂的电化学生物传感器，即使直接在血液及其他复杂基质中检测，仍表现出良好的性能，目前已适用于多种核酸、蛋白质和小分子分析物的检测。本文介绍了一种此类传感器的制备与使用通用方法。

摘要

目前的医学实践中，医生需将样本送至中心实验室进行检测，因此必须等待数小时甚至数天才能获得结果。许多患者将从快速的床旁检测中获益更多。为此，本实验室及其他研究团队已开发出一种多功能、无需试剂的生物传感器平台，可直接在未经处理的临床和环境样本中实现对核酸（DNA、RNA）、蛋白质（包括抗体）以及小分子分析物的定量、无需试剂的电化学检测。在本视频中，我们将演示此类“E-DNA”生物传感器的制备与使用方法。具体而言，我们制备并演示了用于检测聚合酶链式反应混合物中的目标DNA序列、HIV特异性抗体以及可卡因药物的传感器。该制备过程仅需三小时的动手操作时间，随后进行过夜孵育，而传感器的实际使用仅需几分钟。

方案

1. 实验准备

  1. 从定制寡核苷酸合成公司（如 Biosearch Technologies（加利福尼亚州诺瓦托）或 Midland Certified（德克萨斯州米德兰））购买相应的化学修饰探针 DNA。该探针在合成过程中于其 3’-端添加 C6 巯基，并在 5’-端添加氧化还原活性亚甲蓝进行修饰。
  2. 将探针 DNA 溶解于 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水中，配制成浓度为 200 μM 的溶液，并使用分光光度计在 260 nm 处测定吸光度以确认其浓度。由于 DNA 探针上带有亚甲蓝基团，溶液应呈现可见的蓝色。
  3. 新鲜配制 1 mL 的 10 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶液，溶剂为蒸馏去离子水（DI-water）。根据我们的经验，该 TCEP 溶液在 4°C 黑暗条件下保存可保持活性达一周。
  4. 为还原探针 DNA 溶液中可能存在的二硫键，将 1 μL 探针 DNA 储备液与 2 μL TCEP 溶液混合，并用移液器轻轻混匀。将混合物置于黑暗冷藏容器中孵育一小时。随着 TCEP 可逆地还原亚甲蓝，初始呈蓝色的溶液应变为无色。若溶液未变澄清，可使用新鲜 TCEP 溶液重复该步骤，或尝试在室温下进行。
  5. 一小时后，用 1 mL 缓冲液稀释还原后的 DNA 探针溶液，使其浓度稀释至 200 nM。后续实验中，您将把一组金圆盘电极分别浸入 200 μL 该稀释后的探针溶液中进行孵育。
  6. 新鲜配制至少 2 mL 的 2 mM 巯基己醇磷酸盐缓冲盐水溶液。

2. 传感器制备

  1. 在精细抛光布上将0.05微米氧化铝粉末与水混合。将一组金圆盘电极（CH Instruments, Austin, TX）的金表面用力压入湿润的抛光布中，以“8”字形轨迹每电极抛光约三分钟。
  2. 用去离子水冲洗抛光后的电极，并将其浸入装有去离子水的Eppendorf管中，超声处理五分钟以去除残留的氧化铝粉末。
  3. 将电极放入0.5 M硫酸溶液中，连接至电化学工作站，并配合铂对电极和银/氯化银参比电极，进行一系列循环伏安扫描，以氧化、还原并电化学清洁其表面。随后在含有0.01 M KCl的0.1 M硫酸溶液中进行第二次电化学清洗。这些清洗步骤的详细信息可参见我们的Nature Protocols论文1以及本视频的补充材料。
  4. 将一组2 mL Eppendorf管置于试管架中，每管加入200 μL探针DNA溶液。该溶液中探针DNA的浓度将决定其在传感器表面的排列密度。传感器性能高度依赖于探针密度，而最佳密度因不同传感器结构而异。因此，此步骤所用的探针浓度应针对每种新型传感器进行优化2。对于迄今我们研究过的探针结构，此步骤中使用的探针DNA浓度范围为15 nM至2 μM，典型值为200 nM。
  5. 用去离子水冲洗金圆盘电极，然后将其浸入Eppendorf管中的相应探针DNA溶液中，孵育一小时。此时，探针DNA将通过巯基在金表面自组装形成单分子层而固定于电极表面。
  6. 用去离子水冲洗电极后，将其浸入含2 mM巯基己醇的Eppendorf管中，在室温下避光孵育3小时至过夜，以确保自组装单分子层完全形成。此步骤通过引入巯基己醇构建混合单分子层，以保证单层结构的稳定性。为防止蒸发，可用封口膜将电极密封于Eppendorf管中。如需，传感器可在该溶液中保存数天。
  7. 当准备使用传感器时，先用去离子水冲洗，然后在缓冲液中浸泡至少十分钟。用于抗体检测的传感器还必须在使用前浸入100 nM的相关识别链溶液中，随后用缓冲液极快速地冲洗一次。

3. 传感器测试、DNA 检测

  1. 在此方案中，一条17个核苷酸的探针链被固定在金电极上，其3’端带有亚甲基蓝氧化还原标记物（图1）。当探针分子与捕获链杂交时，传感器电路中的电流会降低。
  2. 用去离子水冲洗一支新的传感器，并将其浸入不含目标物的空白样品中，以记录其产生的背景信号。将传感器连接至恒电位仪的工作电极导线。将铂对电极和银/氯化银参比电极插入溶液中。
  3. 以 0 到 -0.6 V 进行方波扫描，振幅为 25 mV，步长为 1 mV。最佳方波频率取决于探针结构的具体细节。2,3；对于探针结构，我们所采用的最优值通常在60至600 Hz范围内。您应能在约-0.35 V处观察到一个圆润的峰，即亚甲蓝的氧化还原电位（该峰电位可能因测试溶液的精确pH值略有偏移）。从基线电流到该峰的高度与亚甲蓝和金电极之间电子转移效率成正比（图2）。保存此背景测量结果。
  4. 将电极转移至含有目标DNA分子的溶液中，平衡5至120分钟（具体时间取决于目标物的大小、结构和浓度4,5），然后采集第二幅方波伏安图。在-0.35 V处的峰高将相对于初始背景测量值发生变化，该变化幅度与分析物的浓度相关，是该传感器的主要输出数据（图3）。
  5. 测量相对信号变化（即相对于背景峰的信号减少或增加的百分比）通常比测量电流的绝对变化更具可重复性，因为这种方法可校正电极表面积的差异。具体操作时，将峰电流与背景峰电流的差值除以背景峰电流。

4. 传感器再生

  1. 测量完成后，将传感器移入盛有去离子水的容器中浸泡 30 秒，或用去离子水持续冲洗 30 秒。用新鲜的去离子水重复此步骤两次。注意：某些分析物对此清洗方法具有抗性；对于此类情况，可尝试使用 6 M 盐酸胍或 70% 乙醇进行强力冲洗。
  2. 将传感器重新放入将要进行测量的溶液中。一分钟内，峰高应恢复至原始值。值得注意的是，这些传感器在首次测试与再生循环中通常会表现出略大的信号变化，而在后续循环中则呈现高度一致的结果6。

5. 传感器测试、抗体检测

  1. 在本实验方案中，这些传感器所使用的亚甲蓝和巯基修饰的DNA探针作为“锚定”链7，直接连接到金电极表面。随后，该锚定链与第二条“识别”DNA链发生杂交，该识别链通过共价键连接相应的抗原（图4）。我们已成功通过商业合成公司（如Biosearch Technologies和Panagene）合成了所需的DNA-抗原嵌合体。杂交步骤的操作方法是将预制好的传感器转移至含有100 nM相应识别DNA链的PBS溶液的Eppendorf管中，孵育1小时。
  2. 将传感器置于相应的空白溶液中，连接至恒电位仪的工作电极引线，并将铂对电极和银/氯化银参比电极插入溶液中。
  3. 按照上述方法进行方波伏安法检测。针对本研究中所采用的特定探针结构，最佳方波频率为60 Hz。您应在约-0.35 V处观察到一个圆润的峰信号。请保存此背景测量数据。
  4. 将电极转移至含有目标分析物的溶液中，孵育5至60分钟，采集第二条方波伏安图。若目标抗体存在，-0.35 V处的峰电流将减小，该变化幅度与抗体浓度相关。

6. 传感器测试，小分子检测

  1. 在此情况下，传感器表面的探针分子是一种适配体，即一种经过筛选的DNA或RNA分子 体外 特异性结合某一分子分析物，并在其与目标分析物结合时发生结构变化（折叠）8,9 （图5）。在此，我们采用Stojanovic开发的可结合可卡因的DNA适体10,11 实验室
  2. 用去离子水冲洗一个新的传感器，然后将其浸入不含目标物的空白样品中，以记录其产生的背景信号。将传感器连接到恒电位仪的工作电极导线上。将铂对电极和银/氯化银参比电极放入溶液中。
  3. 按照上述方法进行方波伏安法检测。对于本实验所采用的特定探针结构，最佳方波频率为200 Hz（但60 Hz也可行）。您应观察到在约-0.35 V处出现一个圆润的峰。保存此背景测量结果。
  4. 将电极转移至含有目标分析物的溶液中，孵育约5分钟，然后采集第二条方波伏安图。在-0.35 V处的峰高将发生变化，该变化幅度与目标分析物的浓度相关。若无法获得可卡因样品，可使用不受管制的普鲁卡因作为替代物。

7. 代表性结果：

当使用第一种结构检测DNA时，在200 nM靶标浓度下平衡后，信号应至少降低60%。 用去离子水短暂冲洗三次后，信号应回到接近原始值的水平（在0.1–5%范围内）。抗体检测传感器的信号应降低40%至80%。 用于可卡因检测的适配体传感器，其信号增幅可达200%，具体增幅取决于工作频率和表面覆盖率。对于可卡因传感器，较低的表面覆盖率效果最佳3。

电化学DNA传感器示意图；通过金电极上的电子转移实现序列检测。
图1. 利用电化学DNA生物传感器检测DNA。

方波伏安法图谱，电位与电流关系，电化学数据分析。
图 2. 方波伏安法过程中E-DNA生物传感器产生的信号截图。

方波伏安法图谱，电位与电流关系，电化学分析，SWV结果。
图3. 屏幕截图显示E-DNA生物传感器在方波伏安法中与分析物杂交前后产生的信号。

带有金电极、靶标检测和电子转移的电化学DNA传感器流程图
图4. 利用支架型生物传感器检测抗体。

DNA杂交；分子靶标在金电极上添加的示意图；电子转移（eT）。
图5. 使用电化学适体生物传感器检测可卡因或普鲁卡因。

定制寡核苷酸序列备注
线性探针DNA（LP17）5′-HS−(CH2)6−TGGATCGGCGTTTTATT−(CH2)7−NH−MB-3′HPLC纯化，可订购含S-S键的形式
目标分析物DNA AATAAAACGCCGATCCA未修饰
识别链5'-Antigen-TEG- CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3' 
支架锚定链 5'-HS-(CH2)6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH2)7-MBHPLC纯化，可订购含S-S键的形式
A4可卡因适配体5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3'HPLC纯化，可订购含S-S键的形式

表1. 探针和靶DNA序列。

讨论

需要注意的是，上述所有实验若要正常进行，电极必须经过适当清洁。以下是我们的电化学清洁步骤指南。使用CH Instruments电化学工作站时，我们通过一组三个宏程序来执行这些清洁步骤。

零相（E-clean O）
将电极浸入0.5 M H2SO4中，并将其连接至恒电位仪的工作电极。同时连接并浸入Ag/AgCl参比电极和铂对电极。首先进行氧化步骤（2 V，5 s），然后进行还原步骤（0.35 V，10 s）。

第一阶段（E-clean 1）
在相同的酸性条件下（0.5 M H2SO4），从 0.35 至 1.5 V 进行氧化和还原扫描（以 4 V/s 的扫描速率和 0.01 V 的采样间隔进行 20 次扫描，随后以 0.1 V/s 的扫描速率和 0.01 V 的采样间隔进行 4 次扫描）。

第二阶段（E-clean 2）
在酸性条件下（0.01 M KCl/0.1 M H2SO4）进行另一组电化学氧化和还原扫描，覆盖四个不同的电位范围（均在0.1 V/s的扫描速率和0.01 V的采样间隔下进行10个循环）：(i) 电位范围从0.2 V到0.75 V；(ii) 电位范围从0.2 V到1.0 V；(iii) 电位范围从0.2 V到1.25 V；(iv) 电位范围从0.2 V到1.5 V。

多种类型的金电极可用于进行这些实验。除了本实验所使用的金圆盘电极外，我们还成功使用了微加工金表面、金丝以及印刷电路板上的金电极。

除了本文所述的传感器外，已有许多其他电化学DNA生物传感器结构被报道。这些结构包括具有假结（pseudoknot）12、三链（triple strand）13、夹心（sandwich）14、超级夹心（super sandwich）15或三螺旋（triplex）16结构的传感器。

未来，我们预计这些传感器将被用于即时医疗诊断。它们已成功整合到多种微流控装置中17,18，相较于光学分析物检测系统具有诸多优势。特别是，这些传感器可在浑浊、光学密度高以及具有强自荧光的样品中正常工作。

致谢

本工作由比尔及梅琳达·盖茨基金会通过大挑战探索计划（项目编号：OPP1015402）以及美国国立卫生研究院（NIH）通过项目编号GM062958-01和2R01EB002046的资助完成。本工作部分是在美国能源部的授权下，由劳伦斯利弗莫尔国家实验室根据合同号DE-AC52-07NA27344执行的。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
金盘电极CH Instruments, Inc.CHI101可重复使用
合成探针DNABiosearch TechnologiesCustom
合成靶标DNASigma-AldrichCustom
巯基己醇Sigma-Aldrich725226-1G需存放于阴凉避光处
铂电极BASiMW-1032可重复使用
Ag/AgCl参比电极BASiMF-2052可重复使用
抛光布Buehler40-7212
氧化铝抛光剂Buehler40-6325-016
磷酸盐缓冲液，pH 7.4Sigma-AldrichP7059-1L
CH Instruments 605ACH Instruments, Inc.605A可使用任意恒电位仪
新生小牛血清Sigma-AldrichN4637-500ML冷冻保存
NanoDropFisher ScientificND-2000可使用任意紫外-可见光分光光度计
PCR混合液Bio-Rad170-8862冷冻保存
可卡因Sigma-AldrichC5776需持有美国药品执法局许可证
普鲁卡因Sigma-AldrichP9879可作为可卡因的替代物
抗Flag抗体Sigma-AldrichF1804-1mg

参考文献

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