本研究介绍了一种结合微波辅助植物样品制备与负染色法用于透射电子显微镜检测的技术，可在约半天内实现对植物病毒病的快速、清晰诊断。
本文内容
摘要
摘要
研究病毒引起的超微结构变化对于明确鉴定植物病毒病常常是必要的。采用传统的透射电子显微镜（TEM）样品制备方法，此类研究通常需要数天时间1,2，因此不适用于植物病毒病的快速诊断。微波固定法可显著缩短TEM样品制备时间，同时获得与传统方法相当的超微结构结果3-5。目前已有多种自制微波设备可用于生物样品的成功固定和包埋，以进行TEM观察5-8。本研究以感染烟草花叶病毒（TMV）的Nicotiana tabacum植株为例，证明利用微波辅助的样品制备方法，可在约半天内完成对叶片中超微结构改变的诊断。我们选择使用一种 commercially available 微波设备进行本研究，因其几乎可全自动完成样品制备过程5，而其他现有设备仍需大量手动操作步骤6-8，耗时且费力。由于样品制备过程完全自动化，可在固定和包埋的同时，对剩余TMV感染叶片汁液中的病毒颗粒进行负染，并进一步观察其超微结构与大小。
方案
微波辅助样品制备
- 在开始样品制备之前，需预先对自动微波组织处理仪（Leica EM AMW；Leica Microsystems，奥地利维也纳）进行程序设置，用于透射电镜（TEM）的微波辅助样品制备（见表1）：
表 1. 采用微波辐照的样品制备程序。各列从左至右依次表示：
- 瓶号（瓶号）：表示样品瓶在处理器转盘中的装载顺序。
- 实际处理步骤。
- 各瓶中的试剂。
- 当前步骤的持续时间。
- 微波辐照关闭前瓶内达到的最高温度。
- 微波辐照设置：连续（Continuous）= 快速升温并维持设定温度；斜坡（Slope）= 缓慢升温，至步骤结束时达到最终温度；脉冲（Pulsed）= 快速升温，当温度下降5°C时关闭功率，待再次升温时恢复功率。
- 微波辐照的最大功率。
- 根据程序设定（表1）新鲜配制样品制备各步骤所需的溶液，将其分装至指定的样品瓶中，将样品瓶装载到转盘上，将转盘插入微波组织处理仪中，最后将第一个样品瓶装入单模腔室。
- 在室温下，于建模蜡板上滴加3%戊二醛（Agar Scientific Ltd.，英国斯坦斯特德）溶于60 mM Sørensen磷酸缓冲液（pH 7.2）中，用剃刀片切取感染烟草花叶病毒（TMV）的Nicotiana tabacum叶片小片（1 mm2）。
- 立即用精细镊子将组织片转移至指定的网孔宽度约为200 μm的篮筐中，将篮筐叠放在一起，并插入单模腔室。在装载和叠放篮筐过程中，必须确保样品始终被固定液完全覆盖，以防干燥。
- 启动预先设定的微波辅助样品制备程序，进行固定、脱水和渗透处理。
- 在微波组织处理仪自动进行样品制备的同时，使用剩余植物材料继续进行负染色操作，具体步骤见第3节（负染色）。
- 新鲜配制Agar 100环氧树脂：按如下方法混合组分——将24 g Agar 100、16 g 十二烯基琥珀酸酐和10 g 甲基纳迪克酸酐（所有组分均来自Agar Scientific Ltd.，英国斯坦斯特德）加入塑料杯中，加热至40°C并充分混匀，随后加入1.2 g 苄基二甲基胺，彻底混合。在样品制备程序即将结束前（例如表1中第22步），将Agar 100环氧树脂注入指定的聚合模具中。
- 程序完成后（表1中第22步结束后），将含有渗透样品的叠放篮筐从单模腔室释放至转盘的最后一个样品瓶中。将转盘从微波仪器中取出，拆开叠放的篮筐，并用精细镊子将样品转移至指定的聚合模具中。在拆解和装载过程中，必须始终确保样品被Agar 100环氧树脂完全覆盖，以防干燥。
- 将聚合模具叠放在一起。在叠放和装载过程中，必须确保样品始终被Agar 100环氧树脂覆盖，以防干燥。
- 从微波组织处理仪的转盘上移除已使用过的样品瓶，装载已叠放的篮筐，并将转盘重新插入仪器中。
- 启动预先设定的聚合程序（表1）。
- 在微波组织处理仪自动进行聚合的同时，使用透射电子显微镜［例如 Philips CM10 TEM，FEI（原 Philips），荷兰埃因霍温］观察负染色网格，并按照第3节和第4节所述进行图像分析（负染色与图像分析）。
- 程序结束后，从单模腔室中取出聚合模具，拆开叠放的模具，取出含有样品的聚合块。样品现已准备好用于切片机切片。
2. 修剪与切片
- 将一个或多个样品块分别插入样品架中，用于超薄切片，使样品顶部露出样品架约1 cm。
- 使用透射电镜专用样品修整仪（例如 Leica Reichert Ultratrim；Leica Microsystems）修整样品块，使块面长度不超过1 mm、宽度约为200 μm，并尽可能包含最多的叶片材料（块面尺寸可能需根据金刚石刀的尺寸进行调整）。
- 使用超薄切片机（例如 Reichert Leica Ultracut S；Leica Microsystems），采用45°刀角的金刚石刀（例如 Diatome Ultra 45，Gröpl，Tulln，奥地利）对样品块进行切片，切片厚度应调整至约70至90 nm，切速约为1 mm/s。用镀有formvar（Agar Scientific Ltd.）的铜或镍200目方格载网捞取多层切片。
- 在培养皿中对载网上的切片进行后染色：先用柠檬酸铅（Agar Scientific Ltd.；1.1 g柠檬酸铅溶于42 mL双蒸水和8 mL 1 N NaOH中）染色5分钟，培养皿内需部分填充NaOH以营造无CO2环境；随后在室温下用1%醋酸铀（Agar Scientific Ltd.）溶于蒸馏水中染色15分钟。每次后染色步骤之间用蒸馏水清洗1分钟。将载网置于载网盒中自然晾干。
- 使用透射电子显微镜（例如 Philips CM10 TEM，FEI，荷兰埃因霍温）观察切片。
3. 负染色法
- 采集约100mg的TMV感染叶片材料，将材料置于载玻片上，加入100μl 60mM Søfrensen磷酸缓冲液（pH 7.2），用刀片研磨2分钟，制备粗汁液。
- 取20μl上述匀浆液转移至带有4个或更多孔的聚四氟乙烯（特氟龙）涂层载玻片的第一个孔中（也可将匀浆液转移至一片Parafilm膜上）。
- 将表面覆有Formvar膜的载网（Formvar coated grid）放置于匀浆液滴上，确保Formvar膜面（Agar Scientific Ltd.）朝向液滴，孵育5分钟。
- 将载网置于两滴200μl 60mM Sørensen磷酸缓冲液（pH 7.2）上，每次2分钟，共洗涤2次。
- 将载网在新配制的2%磷钨酸（Agar Scientific Ltd.）溶于60mM Sørensen磷酸缓冲液（pH 6.5）的溶液中孵育1分钟。
- 取出载网，置于载网盒中自然晾干。
- 使用透射电子显微镜（例如Philips CM10 TEM；FEI，荷兰埃因霍温）观察载网。在21000X或更高的一次放大倍数下，随机选取至少10个负染病毒粒子图像进行拍摄（每张图像中应至少可见10个或更多病毒粒子）。必须确保所有图像的放大倍数一致。
4. 图像分析
- 使用任意图像分析软件（例如 Olympus Life and Material Science Europe GmbH, Hamburg, Germany 的 Cell D 软件，配合颗粒分析工具，或 Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, USA 的 Optimas 6.5.1 软件），测量从负染样品电镜照片中随机选取的至少 100 个单个病毒颗粒的长度和宽度。
- 计算平均值和标准差，以获得通过负染色法和透射电子显微镜（TEM）观察到的病毒颗粒的平均长度和宽度。
- 将测得的长度及超微结构特征（步骤 2.5 中获得）与文献中已知病毒病所引起的病毒大小及超微结构改变进行比较，以明确鉴定病毒病种类。
5. 代表性结果：
经微波辅助样品制备后，通过透射电子显微镜可在感染的Nicotiana tabacum细胞胞质中观察到典型的烟草花叶病毒（TMV）诱导的超微结构改变，例如存在大量呈平行排列的病毒粒子区域（图1A）。此外，在TMV感染叶片的粗汁液中，经负染色后可观察到TMV粒子呈柔韧的杆状结构（图1B）。对100个病毒粒子的图像分析显示，TMV的平均长度为280 nm，宽度为17 nm（图2）。本研究中观察到的TMV感染细胞的超微结构以及病毒粒子的大小，与文献中先前报道的烟草中TMV诱导的超微结构特征及TMV粒子的尺寸范围一致9-15。
图 1. 感染烟草花叶病毒（TMV）的叶片细胞及病毒粒子的透射电子显微镜照片。A) 图像显示经微波辅助植物样品制备后，Nicotiana tabacum 叶肉细胞的超微结构。注意细胞质中大量平行排列并聚集的病毒粒子。C=含淀粉粒（St）的叶绿体，M=线粒体，N=细胞核，V=液泡，标尺=2μm。B) 图像显示通过负染色法在感病叶片汁液中检测到的病毒粒子。
图 2. 病毒粒子的相对大小。对感染叶片汁液进行负染色后，在电子显微镜下观察到的烟草花叶病毒（TMV）颗粒长度与宽度的相对分布。平均值（平均长度/宽度 ± 标准差）由 100 个病毒粒子计算得出。
讨论
微波辅助植物样品制备用于透射电镜（TEM）已被证实可在数小时内提供快速且可靠的超微结构数据3,4,16。本研究所采用方法在细胞器和膜结构的精细结构保存方面，可达到与传统固定及冷冻固定样品相当的水平5,15，同时将样品固定和包埋时间从3天或更长显著缩短至约2小时。这代表了目前文献中报道的最快的透射电镜样品制备方案。本研究描述的方法结合了微波辅助植物样品制备与负染色技术，能够清晰、快速地识别烟草花叶病毒（TMV）诱导的超微结构改变以及病毒颗粒本身。在固定开始后约4小时内，即可完成修块、切片和复染，并在透射电子显微镜下观察TMV诱导的超微结构变化。利用全自动样品制备模式，研究人员可在等待过程中同步进行负染色操作，以确定病毒颗粒的大小和直径。因此，我们可以得出结论：该方法可在约半天内实现对植物病毒病的清晰、快速诊断，这对于未来在农业及植物病理学科研实验中的应用具有重要意义。由于该方法也可用于动物和人类疾病的快速诊断，其在医学和兽医病理学领域具有广阔的应用前景。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由奥地利科学基金（FWF，项目编号P20619和P22988，授予B.Z.）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 戊二醛 | Agar Scientific | R1312 | |
| 四氧化锇 | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 树脂 | Agar Scientific | R1043 | |
| 十二烯基琥珀酸酐 | Agar Scientific | R1051 | |
| 甲基纳迪克酸酐 | Agar Scientific | R1081 | |
| 苄基二甲胺 | Agar Scientific | R1060 | |
| 柠檬酸铅 | Agar Scientific | R1210 | |
| 醋酸铀酰 | Agar Scientific | R1260A | |
| 磷钨酸 | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | 已有更新型号 | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | 已有更新型号 | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 透射电子显微镜 | FEI | 已有更新型号 | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | 已有更新版本 |
参考文献
- Bozzola, J. J., Russell, D. Electron Microscopy. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).
- Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples. Micron. 37, 577-590 (2006).
- Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. J. Microsc. 233, 258-268 (2009).
- Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).
- Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy. Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).
- Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).
- Maeda, H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).
- Milne, R. G. Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology. 28, 527-532 (1966).
- Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells. Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).
- Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).
- Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications. Virology. 348, 475-488 (2006).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases. J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).
- Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol. Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).
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