成年个体的制备 黑腹果蝇 用于薄切片与显微分析的眼组织

摘要

本文介绍了一种用于制备成年Drosophila（果蝇）眼睛以进行半薄切片和光学显微镜分析的标准方法。该方案可用于眼缺陷的宏观形态学分析，或通过文中所述的相应调整，用于确定特定眼细胞类型中基因的遗传需求（例如光感受器细胞的克隆分析），也可用于电镜分析。

摘要

Drosophila 长期被用作研究发育的模式系统，主要原因是其遗传操作简便。多年来，已开发出大量突变品系和技术手段，使得在合理的时间内提出并回答复杂的问题成为可能。通过正向和反向遗传学的 Drosophila 研究，人们已获得关于所有已知主要信号通路组分之间相互作用的基本认识。果蝇的眼睛特别适合进行突变分析，因为在实验室条件下，果蝇即使缺乏功能性的眼睛也能存活。此外，昆虫复眼表面由约800个独立的小眼（小眼面或称小眼单元）组成，在解剖显微镜下观察时形成规则而光滑的表面。因此，通过肉眼观察即可轻易判断突变是否影响了眼睛的发育或生长，例如表面光滑性的丧失（“粗糙眼”表型；图1）或整体眼大小的变化（有关基于外部眼形态筛选的例子，参见例如¹）。对眼表型的进一步详细分析则需要对成年果蝇的眼睛进行固定、塑料包埋和切片处理。

果蝇（Drosophila）的复眼起源于所谓的成虫盘（eye imaginal disc），即一群上皮细胞构成的囊状结构，这些细胞在幼虫和蛹期经历增殖与分化（综述见例如²）。每个小眼（ommatidium）由20个细胞组成，包括8个光感受器细胞（PR或R细胞；图2）、4个分泌晶状体的锥形细胞、色素细胞（围绕R细胞簇形成的“六边形”结构）以及刚毛。每个小眼中的光感受器细胞可通过其光敏感细胞器——小眼面（rhabdomeres）——最易识别，它们排列成一个梯形结构，由6个“外周”光感受器（R1-6）和2个“内层”光感受器（R7/8；R8[图2]位于R7下方，因此仅在眼组织较深层的切片中可见）。每个小眼单元的梯形结构与其相邻单元精确对齐，并与整个复眼的前后轴和背腹轴保持一致（图3A）。特别地，复眼背侧和腹侧（分别为黑色和红色箭头所示）的小眼互为镜像，对应于平面细胞极性信号传导过程中建立的两种手性形式（综述见例如³）。

本文所述制备半薄眼切片（如图3所示）的方法，是在Tomlinson和Ready最初描述的方法基础上稍作修改而来⁴。该方法可用于除透明的锥状细胞外所有细胞的形态学分析。此外，R细胞中的色素（图2和图3中的蓝色箭头）可作为R细胞基因型的细胞自主性标记，因此能够便捷地确定特定R细胞亚群中基因的遗传需求^5,6。

方案

1. 果蝇头部解剖

1. 确保所有材料已备齐（包括明胶包被的载玻片）。配制戊二醛和锇酸固定液（见下文）。每种基因型需进行包埋时，将200μl戊二醛固定液分装至1.5 ml离心管中，并置于冰上。
2. 在CO₂麻醉垫上麻醉果蝇（通常每种基因型解剖七只果蝇头部，以确保有六只可用于包埋，以防操作过程中有一只头部受损）。
3. 用镊子夹住果蝇胸部，背面向上，稍加按压，然后使用锋利的手术刀切下头部。
4. 用镊子轻触果蝇颈部以固定头部，并小心切去其中一只眼睛的一小部分，以增强固定液的渗透性（若计划将眼组织切片用于克隆分析，则应选择无克隆或克隆较小的区域进行切割）。注意避免触碰和损伤后续将用于切片的完整眼睛。
5. 用镊子或手术刀接触已被切除部分的眼表面，将头部转移至冰上的戊二醛/磷酸盐固定液中（头部常漂浮在固定液表面）。解剖后的头部在加入锇酸之前，在戊二醛固定液中存放不得超过15分钟。对同一种基因型的其他果蝇重复步骤1.2–1.5。

2. 固定与包埋（所有步骤均需佩戴手套！）

1. 将果蝇头部在Eppendorf离心机中以10,000 rpm离心1分钟。即使头部未完全沉降也继续后续操作。
2. 加入200μl的OsO₄溶液，在冰上固定至少30分钟，最长可达1小时。
3. 使用巴斯德吸管移除戊二醛/锇酸溶液（务必遵循适当的废液处理程序！），并替换为200μl锇酸溶液。在冰上孵育1–6小时。始终确保头部完全浸没于液体中，切勿将溶液全部移除，以免头部或眼睛塌陷！
4. 使用巴斯德吸管弃去固定液，加入0.5–1ml 30%乙醇，在冰上孵育至少5分钟（由于乙醇现含有锇酸，务必遵循适当的废液处理程序！）。
5. 依次用50%、70%、（80%）、90%以及两次100%乙醇重复上述步骤。若样品将用于透射电子显微镜分析，则需包含80%乙醇步骤。完成70%乙醇洗涤步骤后，样品可从冰上取出。
6. 用等体积的丙烯氧化物替换乙醇（具有挥发性，需继续在通风橱内操作）。室温孵育10分钟。
7. 重复一次丙烯氧化物洗涤步骤。若同时处理多个基因型样品，应分批操作，以避免因丙烯氧化物挥发导致眼睛塌陷。
8. 移除大部分丙烯氧化物，使用塑料移液管加入约500μl的1:1树脂:丙烯氧化物溶液。室温下平衡过夜。

3. 模具中的包埋与排列

1. 确保所有模具均已标记，以便追踪不同基因型，然后用100%树脂填充模具。切勿过量填充（从模具表面水平观察时，树脂表面不应高出模具形成“高丘”）。电镜分析请使用硬性树脂。
2. 使用移液管将头部的50%树脂去除，替换为100%树脂，并在室温下孵育3–4小时。随着头部被树脂浸透，它们会沉入管底。
3. 使用在硬物表面轻敲一次形成微小钩状的牙签，逐个将头部转移到模具中。
4. 在解剖显微镜的工作区域铺上铝箔，以防止树脂溢出造成污染。
5. 使用解剖针并在显微镜下观察，将头部在树脂中轻轻旋转，然后小心地移至模具底部靠近尖端的位置。
6. 仔细将完整（！）的眼表面（或若需横切面，则为未来的切片平面）颈部朝下与模具前壁对齐，确保眼的切向表面距离模具壁约半个头宽。在极少数情况下，眼睛会发生塌陷，表现为眼表面与头部角质层之间出现空隙。若遇到塌陷的眼睛，请更换为第7个^th 备用眼
7. 对所有样本重复此操作。完成全部对齐后，重新检查所有眼睛，确保取出树脂中的针头时样本未发生移动。
8. 如果在移除解剖针时出现眼球移动的情况，可先将眼球调整至理想位置，迅速将解剖针从头部稍作回撤，再缓慢将其完全取出。
9. 在模具中过夜烘烤 70°C.

4. 修剪与切片

1. 通过弯曲模具从模具中取出已硬化的组织块，并记录每个组织块对应的基因型（例如，存放在小型闪烁计数瓶中）。
2. 进行修块时，使用适合您切片机的夹具，将其正面朝上固定在一块有机玻璃或铝块上。将待修整的组织块以眼睛朝上的方向安装到夹具中。
3. 在解剖显微镜下，使用聚四氟乙烯涂层的剃刀刀片，小心地仅切除组织块的最表层。这样会留下一个清晰的表面，透过该表面可观察到眼睛结构，从而预测后续切片的平面。注意避免割伤手指！
4. 将头部两侧及前方多余的包埋介质切除（即最初对齐眼睛时模具的顶部位置），直至大部分包围头部的包埋介质被去除。建议通过多次切除薄层包埋介质的方式逐步接近头部组织。
5. 使用洁净的刀片，沿您后续计划切片的精确平面（通常为与眼球表面相切、并相对于原始模具表面呈轻微角度的方向），小心地从眼球顶部逐层削去薄层组织。
6. 持续修块，直到刚好开始切到眼球的外表面为止。务必使用刀片的洁净区域，以获得光滑透明的切面，这有助于在切片机中更准确地对齐组织。
7. 为节约刀片，可使用较旧的刀片进行组织块侧边的粗修，而使用新刀片进行精细修块（首次切割及第4.6步）。最终应形成一个三面锥体结构，其顶部被轻微倾斜地切平，该切面即为未来的切片平面。
8. 将组织块安装至切片机上。实际切片操作因切片机类型而异，此处不作详细描述。我们使用Sorvall MT5000切片机配合组织级金刚石刀具，切割厚度为0.5至1μm的切片。对于光镜分析，切片厚度的微小变化影响不大。若切片样本为携带White+转基因标记的克隆，则应切1μm厚的切片，以确保每张切片中含有足够数量紧邻小网膜的色素颗粒（图2）。
9. 切下的切片将漂浮于水面。使用木制棉签的扁平端，从水下以旋转动作轻轻挑起前20–30张切片，并转移至载有水滴的明胶包被玻片上（玻片置于约100°C的加热板上）。
10. 重复上述步骤处理另外20–30张切片。等待水分完全蒸发，使切片牢固附着于玻片上。通常，三只眼的切片按三列（每列对应一只眼）和两行（上下层切片）排列，可很好地容纳于一张玻片上。

5. 染色与显微镜分析

1. 除非需要对克隆进行切片，否则直接对切片进行染色。将带有切片的载玻片置于90°C的加热板上。使用连接0.22μm滤器的30 ml注射器将亚甲蓝染色液滴加到载玻片上，染色10秒。立即用蒸馏水充分冲洗。自然晾干。
2. 用塑料移液管在载玻片上滴加3滴DPX封片剂，盖上盖玻片。在上面放置3枚硬币压平，静置使封片剂硬化（例如室温下过夜）。
3. 使用光学显微镜成像。先用5倍或10倍物镜找到合适的切片区域，然后切换至63倍油镜进行详细观察和拍照。我们通常使用相差显微镜设置，但暗场光学系统同样适用。

6. 代表性结果：

通常，为了详细分析在遗传筛选过程中或在检测与已知影响整体眼结构或极性基因的遗传相互作用时所发现的外部粗糙眼表型，眼睛会被包埋在塑料树脂中。典型的眼部切片结果如图3所示。野生型小眼（图3A）显示出完整的眼感光细胞组合，周围由色素细胞构成的晶格结构包围。相比之下，在strabismus（stbm，又名 van-gogh⁷）突变体中，小眼的极性丧失，尽管感光细胞组合完整，但其旋转方向和手性呈现随机化（图3B）。此外，由于被切片的stbm等位基因处于w^-遗传背景中，因此图3B中缺乏色素颗粒。图3C展示了一个克隆分析的示例。果蝇 Rho激酶（drok）不仅对小眼的旋转过程至关重要，也对眼睛的结构完整性具有重要作用⁸。纯合drok²克隆可通过色素细胞及感光束（rhabdomeres）中色素的缺失来识别（通常使用eyeless-FLP系统诱导克隆，并结合一个带有强表达white标记基因的P元件，以弥补野生型和杂合组织中背景的w^-突变）。因此，可通过缺乏色素的区域来识别突变区域。由于前述R细胞中色素沉积具有细胞自主性，因此可以确定单个R细胞的基因型（见图3C中的箭头所示）。

图1. 的 果蝇 眼睛是生物学家的理想模型系统，因为与野生型眼睛的光滑表面相比（A），突变眼的表面外部通常粗糙（B），提示存在潜在的眼部表型。所有图中，腹侧朝左，背侧朝上。图片由美国新墨西哥州拉斯克鲁塞斯市新墨西哥州立大学 Jennifer Curtiss 博士提供。

图2. 采用所述方法切片的单个小眼的光学显微镜图像。每个小眼中每次仅能观察到七个R细胞，因为R7位于R8的上方。（A, A'）在R7层面，R7的细胞体位于R1与R6之间（A'中的黄色箭头所示）。相比之下，在R8层面（B），R8的细胞体位于R1与R2之间（B'中的黄色箭头所示）。蓝色箭头指示可作为细胞自主性色素标记物的色素颗粒。

图3. 野生型（A）、stbm（B）和drok（C）突变体成年黑腹果蝇眼睛的切向切片。切片下方的示意图表示小眼的极性（参见（A）中的箭头）。圆圈代表光感受器组成存在缺陷的小眼。黄色线代表背腹对称线（赤道）。与野生型（A）中小眼排列有序相比，stbm突变体（B）中平面组织结构丧失。注意，所示的stbm突变体切片由于其w^-突变背景而缺乏色素。（C）由于drok突变具有致死性，必须在克隆中进行分析。因此，有色素的细胞为野生型或杂合子（实心蓝色箭头），而缺乏色素的R细胞（空心蓝色箭头）为纯合突变体。除了旋转缺陷外，drok突变体还表现出结构缺陷，包括R细胞缺失或过多。注意，在克隆分析中，切片未染色，以避免遮蔽色素颗粒。

讨论

以Drosophila作为模式生物，遗传筛选已鉴定了许多基因家族的创始成员，这些基因家族对包括人类在内的高等真核生物中高度保守的信号通路至关重要。由于在实验室条件下，功能性眼对果蝇的生存并非必需，因此眼组织特别适合用于发现新的基因功能以及评估遗传网络。利用本文所述方法对果蝇眼进行超微结构分析，从而取得了与发育和疾病相关的一系列基础性发现。最初，通过X射线诱导产生克隆，并结合已知的紧密连锁的细胞自主性隐性标记，进行单细胞克隆分析。近年来，FLP/FRT系统被广泛应用于克隆的产生，极大地方便了对致死性突变在眼切片中的表型分析^6,9。

对眼睛切片的分析不仅限于此处描述的切线切片。如有需要，可将头部在模具中以任意方向排列，从而获得横切面，以研究头部更深层的结构，例如视网膜下层（lamina）和髓质（medulla）。因此，本文所述方案是一种适用于分析黑腹果蝇（Drosophila）成虫眼睛及头部结构的多功能方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>通用设备： <李>有关果蝇常规饲养，请参见 10 标准解剖显微镜（例如 Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope），最好配备环形光源，以避免手部产生阴影。 <李>CO2 果蝇操作垫，覆盖3MM Whatman滤纸，用于解剖过程中防尘保护。 <李>明胶包被载玻片：将10 g明胶和1 g CrKSO₄溶于水中4x 12 H2O，于加热板上加入1 L水中加热（加热至接近沸腾，约需2小时）。将充分洗涤（使用肥皂）并用去离子水冲洗干净的物品浸入其中2将载玻片放入支架中，浸入明胶溶液，用锡箔纸覆盖，室温过夜晾干。<李>加热烘箱（70°C；过去用于干燥硝酸纤维素滤膜的旧式真空烘箱非常适合此用途。<李>能够进行超薄切片（0.5-1 μm）的切片机 μm 厚的切片），例如电镜设施中常用的切片。我们使用 Sorvall MT5000 超薄切片机配合 Histo 级金刚石刀进行切片，玻璃刀也可使用。 <强>固定液： <李>配制 0.2 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）的储备液。<李>配制 2% 戊二醛溶于 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中（可于 4 ℃ 保存）°C下培养4周）。制备的量至少应达到200μ每种基因型取 l，置于冰上保存。<李>锇溶液：2% OsO₄4 在0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中。仅配制足够获得200的量μ每种基因型所需的量单独进行包埋，因为该溶液无法保存。保持在冰上。 戊二醛和OsO₄4 具有高毒性，应在通风良好的通风橱中极其小心地操作。操作 OsO₄ 时应使用滤芯吸头。4 防止移液器变黑。 脱水：配制30%、50%、70%、（80%）、90%和100%的乙醇溶液。使用前建议将30%、50%、70%乙醇置于冰上冷却。 <强>染色液： 1% 甲苯胺蓝溶于1% 硼砂溶液 <表格 边框="1"><胸腹部>
	柔软	硬
树脂A	54g	50g
固化剂B	44.5克	50g
加速器 C	2.5g	1.75克
增塑剂 D	10g	0.75 g

<强>表1. 树脂制备

准备树脂时，使用带大搅拌子的磁力搅拌器，在塑料烧杯中仔细且充分地混合所有成分，避免产生气泡。混合后分装至标准闪烁瓶或类似容器中，并于 -20 ℃ 冻存°C. 除非电子显微镜设施要求使用较硬的配方，否则所有应用均应使用软性树脂。操作树脂时需佩戴手套（未聚合状态下具有致癌性）。为使设备和废弃物上的树脂聚合，需在70℃下烘烤°C过夜。随后可安全丢弃废液，仪器可清洗并重复使用。洒出的未聚合树脂可用异丙醇清理。

<表格 边框="1"><胸椎部>试剂供应商货号果蝇培养垫例如，Genesee59-119戊二醛SigmaG7526-10 X 10 mLOsO₄Polysciences,Inc.0972A-20环氧丙烷Fisher04332-1#3 型手术刀柄Fisher2208004611号手术刀片Fisher08-916-5B移液管Fisher13-711-7MDurcupan (R) ACM 树脂Sigma（Fluka）44610-1EA钢制解剖针FisherS17346BEEM 平板包埋模具电子显微镜科学70904-12特氟龙涂层剃须刀片电子显微镜科学71970棉签（无菌拭子）Fisher14-959-81载玻片Fisher12-550-143盖玻片 No 1，22×60 mmFisher12-531K明胶FisherICN96010280Cr(III) K SO₄ 十二水合物Sigma243361钻石组织切片刀，6 mmDiatome US60-His甲苯胺蓝 OFisherBP107-10硼砂（Na-四硼酸盐）FisherAC20629-1000DPX封片剂Sigma44581-100ML

<强>表2. 材料