测试蛋白质-蛋白质相互作用对于解析蛋白质功能至关重要。本文介绍了一种 体外 利用可溶性蛋白探测膜固定化蛋白的蛋白质-蛋白质结合实验。该实验为检测不溶性蛋白与溶液中蛋白之间的相互作用提供了可靠方法。
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摘要
摘要
验证不同蛋白质之间的相互作用对于研究其在分子水平上的生物学功能至关重要。目前有多种方法可用于评估蛋白质结合，包括体外（in vitro）和体内（in vivo）方法，应至少采用两种能够互补彼此不足的方法，以获得可靠的结果。
对于体内检测，双分子荧光互补（BiFC）检测是目前最常用且侵入性最小的方法，可用于在活细胞内检测蛋白质-蛋白质相互作用，并确定相互作用蛋白的细胞内定位1,2。在该检测中，绿色荧光蛋白（GFP）或其变体的非荧光性N端和C端片段分别与待测蛋白融合；当两种融合蛋白因待测蛋白之间的相互作用而靠近时，荧光信号得以重建3-6。由于该信号可通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜轻松检测，BiFC已成为细胞生物学家研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的首选有力工具3。然而，该检测有时可能产生假阳性结果。例如，由于在较小的亚细胞区室中紧密排列，即使两个GFP片段相距达7 nm，也可能重建荧光信号，而非源于特异性相互作用7。
由于这些局限性，通过活细胞成像技术获得的结果应采用基于不同原理的独立方法来验证蛋白质相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）或谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉实验即为常用的替代方法，可用于体外分析蛋白质-蛋白质相互作用in vitro。然而，在这些实验中，待测蛋白质必须在用于结合反应的缓冲液中具有良好的溶解性。因此，涉及不溶性蛋白质的特异性相互作用无法通过这些技术进行检测。
在此，我们介绍蛋白膜覆盖结合实验的方案，该方法可克服上述困难。在此技术中，由于其中一种蛋白被固定于膜基质上，因此可可靠地检测可溶性蛋白与不溶性蛋白之间的相互作用。该方法结合 体内 实验，例如双分子荧光互补（BiFC），为可靠地研究和表征可溶性与不溶性蛋白之间的相互作用提供了有效方法。本文中，烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）运动蛋白（movement protein, MP）——在病毒细胞间转运过程中发挥多种功能——的结合作用8-14以及最近发现的一种植物细胞互作蛋白——烟草含锚蛋白重复序列蛋白（ANK） 15, 可通过此技术进行演示。
方案
1. 蛋白质的表达与提取
- 对需要检测的蛋白质进行差异标记。将要固定在膜上的蛋白质（ProIM）用较大尺寸的标签进行标记（例如 GST），未融合的标签可用作固定的阴性对照（ProIMnc）。将用作可溶性探针的蛋白质（ProSOL）用较大或较小的标签进行标记。将相同的标签融合至适当的可溶性阴性对照蛋白质（ProSOLnc），并在相互作用检测中包含该对照，以确认所检测到的结合具有特异性。
- 根据目标蛋白质是否需要潜在的翻译后修饰以及蛋白表达量的需求，选择合适的蛋白表达系统来表达带标签的蛋白质，例如 E. coli、杆状病毒系统等。
- 使用含有蛋白酶抑制剂混合物的 SDS-PAGE 上样缓冲液（20% 甘油、4% SDS、20 mM Tris-HCl，pH 6.8），从选定的生物体（步骤 1.2）中提取 ProIM 和 ProIMnc。将细胞悬液在室温下放置 15 分钟，加入 0.5% 的 2-巯基乙醇，煮沸 5 分钟。
- 使用标准方案16从选定的生物体（步骤 1.2）中提取 ProSOL 和 ProSOLnc。这些蛋白质应能 readily 溶于步骤 4.1 中使用的结合缓冲液（140 mM NaCl、10 mM Tris-HCl，pH 7.4、2 mM EDTA、2 mM DTT、1% BSA、0.1% Tween 20）中。
- 使用标准方法（如 Bio-Rad 蛋白检测试剂盒）测定重组蛋白的浓度。若使用粗提物而非纯化蛋白进行检测，可通过考马斯亮蓝 R-250 染色的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上相应条带的密度扫描，并以已知浓度的 BSA 作为参照，估算该粗提物中目标蛋白的浓度。
2. 将 ProIM 和 ProIMnc 固定在膜上
- 根据标准方案16，将两组提取物（每组含有1 μg的ProIM和ProIMnc）在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。
- 电泳结束后，将凝胶转移至含有100 ml转移缓冲液（60 mM甘氨酸，10 mM Tris，0.0006% SDS，20%甲醇）的容器中，室温下轻轻振荡孵育20分钟。
- 根据标准方案16，通过电转移将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。
3. 膜结合蛋白的复性
- 电转印后，将膜置于15 ml缓冲液A（30 mM Tris-HCl pH 7.4，0.05% Tween 20）中，在温和振荡条件下孵育15分钟，以去除残留的SDS。
- 小心沥干后，将膜转移至25 ml变性缓冲液（7 M 盐酸胍，2 mM EDTA，50 mM DTT，50 mM Tris-HCl pH 8.3）中，在室温下温和振荡孵育2小时。（注意：硝酸纤维素膜在变性缓冲液中孵育时会变浑浊）。
- 将膜转移至25 ml TBS（10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.4）中，在温和振荡条件下孵育5分钟。（注意：在此步骤中，膜恢复其原始白色外观）。
- 将膜转移至25 ml结合缓冲液（见步骤1.2）中，在4°C下温和振荡孵育过夜。
4. 利用ProSOL探针检测ProIM
- 将膜切成两条带，每条均包含 ProIM 和 ProIMnc。
- 通过将制备物稀释，分别加入 1-10 μg 的 ProSOL 或 ProSOLnc，溶于 10 ml 新鲜结合缓冲液中，制备 ProSOL 和 ProSOLnc 杂交溶液。将每条膜转移至 ProSOL 或 ProSOLnc 杂交溶液中，室温下轻轻振荡孵育 1.5 小时。
- 从杂交溶液中取出膜，用 TBS 洗涤三次，每次 15 分钟。
5. 通过免疫印迹法可视化蛋白质-蛋白质相互作用
- 用含2.5%脱脂奶粉的TBST（10 mM Tris-HCl，140 mM NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4）在室温下封闭膜1小时。按照生产商推荐浓度，将一抗（抗strepII多克隆兔抗体）用含0.5%脱脂奶粉的TBST稀释。
- 将封闭后的膜置于一抗溶液中，在室温下孵育1小时，或在4°C轻轻振荡孵育过夜。
- 用20 ml TBST在室温下轻轻振荡漂洗膜15分钟，再重复漂洗两次，每次5分钟。
- 按照生产商推荐浓度，将与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（抗兔IgG抗体）用含0.5%脱脂奶粉的TBST稀释。将膜放入二抗溶液中，在室温下轻轻振荡孵育1小时。
- 用20 ml TBST在室温下轻轻振荡漂洗膜15分钟，再重复漂洗两次，每次5分钟。最后一次用TBS漂洗后，使用HRP化学发光底物（例如，Millipore Immobilon Western 化学发光HRP底物）显影蛋白-蛋白相互作用。
- 使用针对与ProIM融合标签的一抗对同一张膜进行探测，随后按照步骤5.1至5.4所述使用相应的二抗。按照步骤5.5所述方法显影ProIM和ProIMnc，以验证蛋白膜覆盖实验（步骤5.5）中获得条带的身份。大多数情况下无需剥离，因为此步骤获得的信号远强于步骤5.5残留的信号。
6. 代表性结果：
通过BiFC在烟草表皮细胞中观察到ANK与MP的相互作用（图1A）。由于MP在细菌或植物中表达时具有高度不溶性，因此采用蛋白质膜覆盖实验验证这一相互作用 体外 （图 1B）。含有蛋白质提取物 1 μg GST-MP（ProIM）或未融合的GST（ProIM）nc通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转至硝酸纤维素膜上。当使用可溶性ANK-strepII（ProSOL）探针检测这些ProIM时，GST-MP表现出结合信号，而未融合的GST则无结合（图1B，泳道1、2，与泳道5、6比较）。此外，当使用无关的ProSOLnc探针检测同一组ProIM时， 拟南芥细胞质 NADH激酶标记strepII（NADH3-strepII）未观察到结合，进一步证明了ANK-MP相互作用的特异性（图1B，泳道3、4）。
图1。 烟草 ANK 与 TMV MP 的特异性结合 体内 和 体外. （A）通过BiFC检测活体烟草表皮细胞中ANK与MP的相互作用。将分别融合了YFP C端和N端片段的MP和ANK编码基因共转染至烟草表皮细胞后，观察到强烈的YFP荧光信号重建。该BiFC信号聚集于细胞边缘的点状结构，此特征为胞间连丝的典型标志 15. （B）ANK-MP 相互作用 体外 通过蛋白质膜覆盖实验检测。含有蛋白质提取物 1 μg GST-MP（ProIM）或未融合的GST（ProIMnc）样品在15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，随后通过电转移至硝酸纤维素膜。将GST-MPProIM和GSTProIMnc与 0.5 μg/ml ANK-strepII（ProSOL）的结合通过使用抗strepII兔多克隆抗体孵育膜，随后使用HRP标记的抗兔IgG+M二抗进行检测（泳道1和2）。GST-MPProIM和GSTProIMnc均不与无关蛋白发生相互作用。 拟南芥 细胞质NADH激酶与strepII标签融合（ProSOLnc，第3和4泳道）。本实验中观察到的条带通过使用抗GST抗体探测膜得以确认（第5和第6泳道）。当膜在未用缓冲液A洗涤的情况下直接用变性缓冲液处理时，GST-MP与ANK的结合消失，而GST-MP和含GST的蛋白提取物中的未识别蛋白仍能与ANK-strepII发生反应，表明在变性处理前执行步骤3.1至关重要（第7和第8泳道）。
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讨论
该方法适用于检测蛋白质组合之间的蛋白-蛋白相互作用，前提是其中至少有一种蛋白质在结合缓冲液中易于溶解，并已成功应用于其他蛋白质组合17,18。在这些条件下，若两种蛋白质均不溶，则无法通过本方案检测其相互作用。
此外，ProIM 的成功复性对于该检测至关重要。电转移后用 TBS 缓冲液冲洗膜是关键步骤，因为残留的 SDS 可能会干扰变性/复性过程。
最后，为避免非特异性结合，结合缓冲液中 ProSOL 的浓度不应超过 1 μg/ml。ProSOL 浓度过高时，可能会与 ProIM 发生非特异性结合。此外，为阻断膜上固定化蛋白与 ProSOL 的非特异性结合，可在步骤 4.2 使用的杂交缓冲液中用脱脂奶粉替代 BSA。
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致谢
我们实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）、美国农业部国家食品与农业研究所（USDA National Institute of Food and Agriculture）、美国国家科学基金会（NSF）、美以双方农业研究与发展基金（BARD）、美国能源部（DOE）以及美国-以色列两国科学基金会（BSF）向 V.C. 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质检测试剂盒 | Bio-Rad | 500-0001 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-PROTEAN 电泳系统 | Bio-Rad | 165-8000 | |
| 半干式转膜仪（SD 电转移系统） | Bio-Rad | 170-3940 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔 IgG 抗体 | GenScript | A00098 | |
| 抗 GST 兔多克隆抗体 | GenScript | A00097 | |
| 抗 StrepII 抗体 | GenScript | A00626 | |
| BioTrace NT 硝酸纤维素转印膜 | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon Western 化学发光 HRP 底物 | EMD Millipore | WBKL S0 050 |
参考文献
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
- Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
- Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
- Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
- Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
- Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
- Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
- Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
- Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).
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重印与许可
