测试蛋白质-蛋白质相互作用对于解析蛋白质功能至关重要。本文介绍了一种 体外 利用可溶性蛋白探测膜固定化蛋白的蛋白质-蛋白质结合实验。该实验为检测不溶性蛋白与溶液中蛋白之间的相互作用提供了可靠方法。
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本文内容
摘要
摘要
验证不同蛋白质之间的相互作用对于研究其在分子水平上的生物学功能至关重要。目前有多种方法可用于评估蛋白质结合，包括体外（in vitro）和体内（in vivo）方法，应至少采用两种能够互补彼此不足的方法，以获得可靠的结果。
对于体内检测，双分子荧光互补（BiFC）检测是目前最常用且侵入性最小的方法，可用于在活细胞内检测蛋白质-蛋白质相互作用，并确定相互作用蛋白的细胞内定位1,2。在该检测中，绿色荧光蛋白（GFP）或其变体的非荧光性N端和C端片段分别与待测蛋白融合；当两种融合蛋白因待测蛋白之间的相互作用而靠近时，荧光信号得以重建3-6。由于该信号可通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜轻松检测，BiFC已成为细胞生物学家研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的首选有力工具3。然而，该检测有时可能产生假阳性结果。例如，由于在较小的亚细胞区室中紧密排列，即使两个GFP片段相距达7 nm，也可能重建荧光信号，而非源于特异性相互作用7。
由于这些局限性，通过活细胞成像技术获得的结果应采用基于不同原理的独立方法来验证蛋白质相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）或谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉实验即为常用的替代方法，可用于体外分析蛋白质-蛋白质相互作用in vitro。然而，在这些实验中，待测蛋白质必须在用于结合反应的缓冲液中具有良好的溶解性。因此，涉及不溶性蛋白质的特异性相互作用无法通过这些技术进行检测。
在此，我们介绍蛋白膜覆盖结合实验的方案，该方法可克服上述困难。在此技术中，由于其中一种蛋白被固定于膜基质上，因此可可靠地检测可溶性蛋白与不溶性蛋白之间的相互作用。该方法结合 体内 实验，例如双分子荧光互补（BiFC），为可靠地研究和表征可溶性与不溶性蛋白之间的相互作用提供了有效方法。本文中，烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）运动蛋白（movement protein, MP）——在病毒细胞间转运过程中发挥多种功能——的结合作用8-14以及最近发现的一种植物细胞互作蛋白——烟草含锚蛋白重复序列蛋白（ANK） 15, 可通过此技术进行演示。
方案
1. 蛋白质的表达与提取
- 对需要检测的蛋白质进行差异标记。将要固定在膜上的蛋白质（ProIM）用较大尺寸的标签进行标记（例如 GST），未融合的标签可用作固定的阴性对照（ProIMnc）。将用作可溶性探针的蛋白质（ProSOL）用较大或较小的标签进行标记。将相同的标签融合至适当的可溶性阴性对照蛋白质（ProSOLnc），并在相互作用检测中包含该对照，以确认所检测到的结合具有特异性。
- 根据目标蛋白质是否需要潜在的翻译后修饰以及蛋白表达量的需求，选择合适的蛋白表达系统来表达带标签的蛋白质，例如 E. coli、杆状病毒系统等。
- 使用含有蛋白酶抑制剂混合物的 SDS-PAGE 上样缓冲液（20% 甘油、4% SDS、20 mM Tris-HCl，pH 6.8），从选定的生物体（步骤 1.2）中提取 ProIM 和 ProIMnc。将细胞悬液在室温下放置 15 分钟，加入 0.5% 的 2-巯基乙醇，煮沸 5 分钟。
- 使用标准方案16从选定的生物体（步骤 1.2）中提取 ProSOL 和 ProSOLnc。这些蛋白质应能 readily 溶于步骤 4.1 中使用的结合缓冲液（140 mM NaCl、10 mM Tris-HCl，pH 7.4、2 mM EDTA、2 mM DTT、1% BSA、0.1% Tween 20）中。
- 使用标准方法（如 Bio-R....
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讨论
该方法适用于检测蛋白质组合之间的蛋白-蛋白相互作用，前提是其中至少有一种蛋白质在结合缓冲液中易于溶解，并已成功应用于其他蛋白质组合17,18。在这些条件下，若两种蛋白质均不溶，则无法通过本方案检测其相互作用。
此外，ProIM 的成功复性对于该检测至关重要。电转移后用 TBS 缓冲液冲洗膜是关键步骤，因为残留的 SDS 可能会干扰变性/复性过程。
最后，为避免非特异性结合，结合缓冲液中 ProSOL 的浓度不应超过 1 μg/ml。ProSOL 浓度过高时，可能会与 ProIM 发生非特异性结合。此外，为阻断膜上固定化蛋白与 ProSOL 的非特异性结合，可在步骤 4.2 使用的杂交缓冲液中用脱脂奶粉替代 BSA。
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致谢
我们实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）、美国农业部国家食品与农业研究所（USDA National Institute of Food and Agriculture）、美国国家科学基金会（NSF）、美以双方农业研究与发展基金（BARD）、美国能源部（DOE）以及美国-以色列两国科学基金会（BSF）向 V.C. 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质检测试剂盒 | Bio-Rad | 500-0001 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-PROTEAN 电泳系统 | Bio-Rad | 165-8000 | |
| 半干式转膜仪（SD 电转移系统） | Bio-Rad | 170-3940 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔 IgG 抗体 | GenScript | A00098 | |
| 抗 GST 兔多克隆抗体 | GenScript | A00097 | |
| 抗 StrepII 抗体 | GenScript | A00626 | |
| BioTrace NT 硝酸纤维素转印膜 | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon Western 化学发光 HRP 底物 | EMD Millipore | WBKL S0 050 |
参考文献
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V.
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重印与许可
