活体小鼠肝脏灌注：通过门静脉向啮齿类动物肝脏灌注溶液的方法

摘要

来源：Cabral, F. 等。通过小鼠肝脏灌注纯化肝细胞和窦状内皮细胞。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种通过门静脉灌注胶原酶溶液以分离小鼠肝细胞前的肝脏灌流操作步骤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备

1. 溶液和培养基的制备
   1. 根据材料表中的说明配制所有培养基和缓冲液。
2. 仪器的准备
   1. 准备一个42 °C的水浴锅（>10 L）、一个带可调转速的蠕动泵以及用于固定烧瓶的夹子。准备好弯头剪刀和镊子（图1）。
   2. 在水浴锅上或其附近放置一个烤盘（约38 × 26 cm），上面垫一块泡沫塑料垫（50 mL离心管架），再覆盖一块裁剪成20 × 20 cm大小的吸水垫（图1）。
   3. 在附近放置一段5–8 cm长的医用胶带。放置一段已剪好、可直接使用的20 cm长聚酯缝合线。准备一根带可缩回针头的塑料导管（7 mm × 19 mm，图1）。
3. 玻璃器皿的准备
   1. 使用夹子将一个1 L烧瓶固定在水浴中，瓶内加入200 mL 1× PBS，并用带有两个插入溶液中的1 mL移液管的塞子密封。橡胶塞上有切口，以便在封闭回路中实现液体循环。
   2. 用另一个夹子将一个125 mL烧瓶固定在水浴中，瓶内加入45 mL Buffer 2，并用带有两个1 mL移液管的塞子密封；其中一个移液管插入液面底部，另一个位于液面上方，用于向瓶内通入氧气。
      注意：塞子中的每个移液管末端均连接一个快速接头适配器，以便于快速更换管路。通过未浸入液体的移液管，氧气将缓慢通入两个烧瓶中。
   3. 预留两个无菌的结晶皿备用。

2. 动物实验步骤

1. 将 PBS 和缓冲液 2 在水浴中预热至 42 °C，并以闭合回路循环 PBS，流速至少为 20 mL/min，以保持液体管路温暖。将多余的管路浸入水浴中，使其温度尽可能接近 42 °C。将管路的雄端排入含有 PBS 的 1 L 锥形瓶中。
2. 将棉球置于吸水垫上，使用移液管向棉球上加入约 2 mL 的 30% 异氟烷（用聚乙二醇 200 配制，可降低异氟烷的蒸发速率）。
3. 抓住小鼠尾巴，将其放入其中一个结晶皿中，然后迅速将结晶皿倒扣在棉球上，使小鼠处于一个可吸入麻醉气体的小空间内。观察小鼠的呼吸频率，并确保其已有效进入麻醉状态。
   注意： 麻醉状态下，小鼠呼吸应变慢且加深，尾巴松弛，脚趾对夹捏测试无反应；更多细节请参见 IACUC 指南。
4. 在小鼠进入麻醉状态期间（通常需要 1–2 分钟），准备一支 10 mL 注射器的筒身：拉出活塞，在筒身内放入一小团棉球。使用移液管向筒身内的棉球加入 1–2 mL 的 30% 异氟烷，并将筒身开口端朝下放置于桌面上，等待小鼠完全失去意识。
5. 迅速取下结晶皿，将小鼠翻转为仰卧位，并将注射器筒身罩在其鼻部。再次检查呼吸频率、脚趾夹捏反应及尾巴松弛程度。若对脚趾夹捏或尾巴松弛测试仍有反应，表明小鼠尚未完全麻醉。保持注射器筒身覆盖鼻部以维持无意识状态。
6. 用图钉穿过小鼠四肢脚掌，使其肢体伸展呈仰卧位。用 70% 异丙醇或乙醇润湿腹部和肋骨区域。
7. 一手持直镊，提起腹部基部附近的皮肤；另一手持剪刀，剪开被提起的皮肤和腹膜。切口应呈水平方向，横跨被提起皮肤的基部。务必剪透所有皮肤和腹膜层，以便进入腹腔。沿腹部两侧向肋骨区域横向剪开，注意不要损伤任何器官。
8. 在下部肋骨区域横向剪断皮肤瓣。用镊子背面将肠道向右侧移动，以暴露门静脉。
   注意： 动物出血量应极少；动物应仍保持呼吸并处于深度麻醉状态。
9. 将闭合的弯镊置于门静脉下方，位于肝脏与胰十二指肠上静脉之间（图 2 箭头所示）。
10. 在门静脉下方打开弯镊。抓住缝线，小心将其拉过，使缝线居中位于门静脉下方。在门静脉周围打一个单结，但暂不收紧。
11. 将弯镊置于门静脉下方，轻轻向小鼠尾部方向牵拉，以拉直血管（图 3A）。
12. 另一手持导管，将针头斜面朝上，与靠近镊子处的门静脉下段平行放置（图 3B）。
13. 用针头轻轻穿刺血管（图 3C）。确保针头斜面进入血管腔内。回撤弹簧加载的针芯，继续推进聚合物导管进入血管，直至斜面接近静脉分支区域（位于肝脏内部）。若导管位置正确，可见血液回流（图 3D）。
14. 收紧单结，并将其沿导管向下拉紧以帮助固定。立即将泵速从 20 mL/min 降低至 4 mL/min，并切断另一主要血管用于引流。为获得最佳效果，应切断腹主动脉。
15. 将管路的雄端连接至导管的雌端（图 4A）。确保管路中无气泡。注意避免将导管推入肝脏或脱出血管。缝线的放置并非必需，但有助于防止血液从血管回流，并帮助维持导管在正确位置（图 4B, C）。
16. 使用美纹纸胶带将管路固定在垫子上。用直镊挤压流出血管数次，使肝脏膨胀，以确保所有血液均已排出（图 4D）。
    注意： 普通实验室胶带可能无效；然而，美纹纸胶带即使在潮湿条件下也能牢固粘附于垫子上。

3. 肝脏灌注

1. 在肝脏用 PBS 灌注的同时，称取约 24 mg IV 型胶原酶，并将其放入盛有 45 mL 缓冲液 2 的烧瓶中，置于水浴中。务必轻轻摇动烧瓶中的液体，使胶原酶完全溶解，并将烧瓶重新固定于夹具上，确保烧瓶中含液体部分完全浸没在水中。
2. 观察肝脏在 PBS 灌注过程中颜色的变化。将流出管路由 1 L 烧瓶切换至 125 mL 烧瓶。注意避免气泡进入肝脏。
3. 当灌注液到达肝脏时，短暂捏紧流出血管以在血管内建立一定压力，使液体充满肝脏的所有叶。注意不要阻断引流过久，以免导致包绕肝脏的薄层结缔组织（Glisson 被膜）破裂，从而破坏肝脏毛细血管床内的灌注或液体流动。
4. 使含胶原酶的缓冲液 2 继续灌注肝脏，直至全部 45 mL 液体通过组织。
   注意： 若操作成功，Glisson 被膜应与肝实质或肝组织分离，肝脏本身应呈现无定形外观。
5. 向另一个结晶皿中加入约 10 mL 缓冲液 1，并将其放置在小鼠旁边。
6. 移除导管并关闭泵。
7. 使用直镊子和剪刀将肝脏从小鼠体内取出。如果胶原酶消化效果很好，可能需要准备一个洁净无菌的勺子，用于将肝脏从体内舀出并放入缓冲液 1 中。

结果

图1：灌注系统的示意图。 烧瓶由夹具固定（图中未显示）；在操作过程中，连接液体的管路从1L烧瓶切换至125 mL烧瓶，以红色虚线表示。注意，氧气进气并不直接在烧瓶溶液中产生气泡。塞子应切有凹槽，以便插入凹槽内的管路实现闭合回路的液体流动。这在预热管路以及排出管路中所有空气时至关重要。排气装置由T型接头组成，连接Tygon管和止流夹，可快速打开和关闭系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 L 锥形瓶	Fisher Scientific	S63274
250 mL 锥形瓶	Fisher Scientific	S63271
硅胶管 	Cole-Parmer	96400-14	该管路从烧瓶经泵连接至T型接头，再连接至与导管相连的1.0 mL注射器。
Tygon 管	Fisher Scientific	R3603	用作96400-14与移液器及T型连接头之间的适配器。  这也可用于氧气管路。
三通接头	Cole-Parmer	EW-06294-82
快速断开连接	Fisher Scientific	6150-0010
止血钳	Fisher Scientific	6165-0002
Masterflex L/S 可调速泵；型号 7553-70	Cole-Parmer	EW-07559-00	可变速率的周边泵
泵头；型号 7014-20	Cole-Parmer	EW-07014-20
玻璃刻度1.0 mL移液管 	Fisher Scientific	13-678
弯头无齿剪刀	Fine Science Tools	14069-12
杜蒙镊	Fine Science Tools	11252-20
弯头镊子	Fine Science Tools	13009-12
10 mL 注射器	Fisher Scientific	03-377-23	仅需注射器筒身
无菌勺	家用物资商店
棉球	家用百货商店
聚酯缝纫线	家用物资商店
美纹纸胶带	家用供应商店
图钉	家用物资商店
泡沫垫 	50 mL 锥形离心管架
饼干/烤盘	家用供应商店
吸水垫	Fisher Scientific	14-206-64
19 L 水浴锅	Fisher Scientific	TSCOL19
BD Insyte Autoguard 防护型静脉留置针 24 号	Becton Dickinson	381412	带可缩回针头的塑料导管
结晶皿 100x50	VWR 	89000-290
聚苯乙烯培养皿	Sigma Aldrich	P5481-500EA
50 mL 一次性离心管	Fisher Scientific	12-565-270
刻度移液管（5 mL）	Fisher Scientific	170355
刻度移液管（25 mL）	Fisher Scientific	170357
EasyStrainer 100 µM	Greiner bio-one	542000	100 µm 滤膜
EasyStrainer 40 µM	Greiner bio-one	542040	40 µm 滤膜
<强>试剂</strong>
<强>名称</strong>	<强>化合物</strong>	<强>克（g/L）</strong>	<强>毫摩尔每升（mM）</strong>
缓冲液1；pH 7.4	NaCl	8.3	142
	KCl	0.5	6.7
	HEPES	2.4	10
	BSA	15	0.226
缓冲液2；pH 7.4	NaCl	3.9	66.74
	KCl	0.5	6.71
	CaCl2	0.7	6.31
	HEPES	24	100
	BSA	15	0.226
	酚红	0.01	0.03
PBS；pH 7.4	NaCl	8	137
KCl	0.2	2.7
Na2HPO4-7H2O	1.15	4.3
KH2PO4	0.2	1.4
<强>其他试剂</strong>
<强>名称</strong>	<强>公司</strong>	<强>货号</strong>	<强>评论</strong>
IV型胶原酶	Sigma Aldrich	C5138
异氟烷&nbsp;	Abcam	ab144581