小鼠颅骨窗制备模型：一种在小鼠颅骨顶部创建窗口的外科手术方法

摘要

来源：Geisler, J. A. 等. 通过颅内注射与磁共振成像建立脑转移模型. J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们描述了为进入小鼠模型大脑而制作颅骨窗的手术操作步骤。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 为手术准备立体定位仪

1. 开启所有麻醉机、数字游标卡尺和数字注射器。
   注意：所有手术器械应在手术前充分清洁并灭菌。
2. 在生物安全柜中使用带有诱导室附件的麻醉机（图1A）。
3. 确保麻醉机的所有管路均已连接至立体定位仪（图1B，插图1C），并且正在使用的设备管路上的夹子均处于打开状态。对于不用于手术的立体定位仪管路，应关闭其上的夹子。
4. 根据小鼠体重，将麻醉机设置为制造商推荐的鼻罩气流流速（例如，25 g动物体重：鼻罩流速为34 mL/min）。
   注意：本立体定位系统所配备的头部固定器仅建议用于成年小鼠。请确保遵循立体定位系统附带的制造商说明。
5. 确保已将合适的麻醉剂（例如异氟烷）预先装填于注射器中，并连接至麻醉机（图1B）。
   注意：注射器过度预充可能导致手术过程中向小鼠输送过量麻醉剂，从而引起麻醉过量。
6. 通过旋转平台锁紧装置，将钻头适配器和1 mm钻头插入每台钻机中，并通过手动拧紧钻头锁进行固定，完成钻机准备。
7. 将钻机安装到立体定位仪上（图1C）。

2. 将小鼠固定于立体定位仪

1. 使用上述诱导室对小鼠进行麻醉（例如，使用异氟烷）。
2. 在整个操作过程中维持小鼠处于深度麻醉状态。麻醉机输送的麻醉剂百分比取决于多种因素，包括：气流速率、刺激程度和体温。在操作过程中应频繁监测小鼠的麻醉深度，通过观察是否存在节律性呼吸（动物无喘息现象）、缺乏眼睑反射（用棉签轻轻刺激眼睑时不出现眨眼）以及缺乏脚趾夹捏反应（夹捏脚趾时肢体无回缩）来判断。
   注意： 不同品系的小鼠对麻醉的反应可能不同。
3. 当小鼠达到适当的深度麻醉状态后，将其转移至立体定位仪。在小鼠置于立体定位仪期间使用加热垫以维持其体温和适宜的麻醉水平。
   注意： 为实现低剖面设计，我们使用置于倒置移液器吸头盒内的空气激活暖手袋（见图1D中的小鼠抬高盒）。
4. 打开小鼠口腔，将其门齿放入立体定位仪鼻夹装置上的齿槽内（图2A）。将鼻罩滑过小鼠的鼻部/口部（图2B）。
   1. 放置小鼠时应使其头部与齿槽保持水平。使用棉签的钝端轻轻打开口腔，并将其滑入到位。确保鼻罩完全覆盖小鼠鼻部，否则麻醉气体无法正常输送。如果门齿未卡入该凹槽，则鼻罩无法正确贴合鼻部（图2A插图）。
5. 使用无菌棉签将眼用润滑剂涂抹于每只小鼠的眼睛上。使用眼用润滑剂可防止角膜干燥，降低角膜损伤及相关术后并发症的风险。
6. 通过将左侧耳杆向下压紧左耳内眦，并使用立体定位仪上的螺丝固定，以稳定小鼠颅骨。随后，将右侧耳杆滑向右耳内眦，并在立体定位仪上旋紧螺丝（图2B）。
   注意： 安装耳杆时应确保小鼠头部水平且正直。若头部歪斜或倾斜，脑内注射位置将不准确。耳杆仅需拧紧至在中等手动探触刺激下颅骨不再移动即可。

3. 制作颅骨窗

1. 使用聚维酮碘溶液和70%乙醇交替进行3次头皮准备和清洁。由于手术部位靠近眼睛，应使用聚维酮碘溶液进行手术区域消毒。
2. 使用无菌手术刀沿颅骨中线（沿矢状缝）做一道3 mm的皮肤切口。切口处出血应极少。若发生出血，使用无菌棉签在出血部位持续施加稳固压力，时间不少于>30秒。
3. 确定钻头位置，并使其垂直于前囟点（图2C），同时确保将数字游标尺归零。
4. 将钻头移至矢状缝外侧2 mm、冠状缝前方1 mm处（图2C）。为保证实验可重复性，所有动物的钻孔位置应始终位于矢状缝的同一侧（左侧或右侧）。
5. 将钻头调至最高速度。确保皮肤远离钻头，以避免旋转钻头造成组织损伤，并小心地将钻头接触颅骨表面。在颅骨上钻出约0.5 mm深的孔，形成颅骨窗。注意不要将钻头下压过深，以免损伤脑组织。在钻孔过程中向钻点滴加无菌生理盐水，可抵消设备运转产生的热量，防止周围组织发生热损伤。
6. 完成颅骨窗制备后，小心抬起并从立体定位仪上移除钻头。
7. 使用70%乙醇清洁钻头，如需再次使用则妥善放置；如不再使用，应取下钻头并浸入70%乙醇中。

结果

图1： 立体定位与麻醉系统。 （A） 生物安全柜内的麻醉诱导室装置。 （B） 立体定位麻醉给药装置，显示从麻醉机至立体定位仪鼻罩的麻醉管路（见（C）插图）。绿色箭头指示输送的麻醉气体管路，蓝色箭头指示回收气体管路。 （C） 带有钻头附件的立体定位架。插图显示麻醉管路（绿色和蓝色箭头）、口杆和耳杆。 （D） 带有自动注射泵和小鼠抬高盒的立体定位架。该盒子为倒置的移液器吸头盒，内含暖手袋，用于将小鼠抬升至适当高度并维持体温。插图显示 Hamilton 注射器在自动注射装置中的方向。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>手术材料</strong>
贝塔碘（Betadine）	Purdue Products	19-027132	聚维酮碘，7.5%
骨蜡	Surgical Specialities	903	无菌可塑性蜂蜡和棕榈酸异丙酯
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	长效注射用镇痛剂，5 mL（0.5 mg/mL）聚合物制剂
棉签	Puritan	25-806 10WC	无菌长柄棉签
眼膏	Puralube	17033-211-38	润滑性凡士林和矿物油基眼用软膏
暖手袋&nbsp;	Hothands	&nbsp;HH2	空气激活发热包
布洛芬	Up &amp; Up	094-01-0245	液体混悬剂，每5 mL含100 mg
异氟烷	Henry Schein INC	1182097	用于麻醉蒸发器的液态麻醉剂
手术刀	Integra Miltex	4-410	#10 一次性手术刀片
缝合线	Covidien	SP5686G	45 cm 带针5-0单丝聚丙烯缝合线
<strong>立体定位仪</strong>
高速钻机（Foredom）	Kopf	Model 1474	最高转速38,000 RPM
小鼠气体麻醉头固定器	Kopf	Model 923-B	带齿孔的咬齿杆和鼻罩
非穿刺式耳杆	Kopf	Model 922	适用于小鼠的耳杆
立体定位仪	Kopf	Model 940	带数字显示 monitor 的基板、框架和线性刻度组件
麻醉机
SomnoSuite 低流量数字蒸发器	Kent Scientific	SS-01	数字式麻醉机
SomnoSuite 小鼠起始套装	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	包含诱导室、2支麻醉注射器、18" 管路、塑料鼻罩、2个废气吸收罐