小胶质细胞吞噬作用检测：利用iPSC来源的巨噬细胞建立针对神经母细胞瘤细胞的体外小胶质细胞吞噬模型

摘要

来源：Hall-Roberts, H. 等 利用iPSC来源巨噬细胞体外定量成像检测吞噬死亡神经母细胞瘤细胞的实验方法. J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们利用诱导性多能干细胞对神经母细胞瘤进行小胶质细胞吞噬功能检测。该检测有助于评估神经退行性疾病中小胶质细胞功能的损伤情况。

方案

1. 使用pH敏感性红色荧光染料标记死亡的SH-SY5Y细胞

1. 从悬浮在无酚红 HEPES 缓冲培养基中的固定 SH-SY5Y 细胞开始。计数细胞，并将所需总数的细胞转移至一个 2 mL 低蛋白结合力离心管中。每 100 万个 SH-SY5Y 细胞，将 2 mL 管中的总体积调整至 300–500 µL 酚红-free HEPES 缓冲液。在 37℃ 下短暂预热管子 °C 水浴
2. 将pH敏感性红色荧光染料STP酯重悬（参见 材料表）并加入12.5 µ将染料按每百万个SH-SY5Y细胞加入适量克数至含有2 mL细胞的预热离心管中。用移液器轻轻混匀。室温避光孵育30分钟。    
   注意： pH敏感性染料的STP酯形式可与伯胺发生反应，因此标记缓冲液中不得含有游离胺。由于该染料在水相缓冲液中溶解度可能有限，应将溶于DMSO的染料仅加入温热的水相缓冲液中，立即混匀，并观察是否有沉淀产生（在光学显微镜下可见暗色颗粒）。
3. 加入 1 mL HBSS，以 1200 x g 4℃下7分钟 °C. 弃去上清液，加入 2 mL HBSS 洗涤。重复离心步骤。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于不含酚红的巨噬细胞培养基中（参见 材料表) 调整至浓度为 200,000–1.2 百万细胞/mL，以便加入 50 µL 为 10,000–60,000 个细胞（即, SH-SY5Y细胞数量为iPSC来源巨噬细胞的0.5至3倍。
   注意： 培养基中的酚红会增加背景荧光，因此若进行活细胞成像，应使用不含酚红的培养基。不建议将染色后的SH-SY5Y细胞保存超过数小时，因为此条件尚未经过评估。染色后的SH-SY5Y细胞应置于冰上并避光保存。

2. iPSC-巨噬细胞的染色

1. 在生物安全柜中，用巨噬细胞培养基配制一种深红色荧光、可穿透细胞膜、可与琥珀酰亚胺酯反应的染料溶液（参见 材料表）。加入 Hoechst 33342（参见 材料表）。将工作液预热至37 °在水浴中于 C。
2. 轻轻吸弃iPSC-巨噬细胞培养基，使用多通道移液器将细胞上清液转移至无菌储液槽中。加入70 µ染料溶液每孔体积 步骤 2.1 使用多通道移液器将iPSC-巨噬细胞加入，于37℃孵育1小时 °C 和 5% CO₂₂.
3. 在不含酚红的巨噬细胞培养基中配制实验处理液。包含 10 µM 细胞松弛素 D 作为阴性对照处理。孵育后，用多通道移液器非常轻柔地吸除iPSC-巨噬细胞培养基，并加入100 µ每孔加入 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤，轻轻吸弃 HBSS，然后加入 100 µL 培养基 ± 化合物。在37℃下孵育10分钟至1小时 °C 和 5% CO₂.
   注意： 细胞松弛素D是一种强效的肌动蛋白抑制剂，可阻断吞噬作用。对于需要较长孵育时间（例如24–72小时）的任何实验处理，应在进行该实验处理之前 步骤 2.1，使用100 µ每孔加入含治疗药物的完全巨噬细胞培养基。继续操作 步骤 2.1–2.3 按照方案进行，以便进行细胞染色，随后在不含酚红的巨噬细胞培养基中重新施加处理，用于吞噬作用检测的剩余阶段。

3. 成像吞噬作用

1. 固定细胞高内涵成像
   1. 使用多通道移液器将每孔50 µL标记的SH-SY5Y细胞加入孔板，沿液体边缘贴壁加入。在37 °C、5% CO₂ 条件下孵育3–5小时。
   2. 吞噬作用孵育结束后，使用多通道移液器轻轻吸除各孔上清液并弃去。用100 µL PBS洗涤一次。
   3. 每孔加入100 µL 2%多聚甲醛进行固定，在室温下孵育15分钟。
   4. 吸除孔内液体，每孔加入100 µL PBS。用封板膜密封后包裹铝箔；根据需要存放于4 °C环境中。
      注意：该检测板在此条件下至少可稳定保存一周，信号无明显衰减；更长时间的保存尚未测试。
   5. 开启高内涵成像显微镜（见 材料表），打开图像采集软件。点击屏幕顶部的 加载 图标，将检测板载入显微镜。
   6. 选择 设置 选项卡。在左上角框内的下拉菜单中：选择合适的板型，选择自动对焦模式 双峰（默认），选择物镜 40x 水镜，NA1.1，选择 共聚焦 模式，并设置 binning 值为 1。
   7. 通过 设置 菜单在使用前冲洗40x水镜物镜。
   8. 在 通道选择 框中，点击“+”图标添加DAPI、Alexa 647和Alexa 568通道。将这些通道设置为在1 µm的单一层面上进行测量。根据检测板的染色效率优化 时间 和 功率 参数。
      注意：作为参考，建议设置DAPI曝光时间为200 ms、功率为100%，Alexa 647曝光时间为1500 ms、功率为100%，Alexa 568曝光时间为100 ms、功率为40%。
   9. 点击 通道序列 以分离各通道，确保各通道不同时测量。
   10. 在 导航 | 定义布局下，选择待测量的孔，并为每孔选择9–12个视野。
   11. 在设置过程中，点击板图上的代表性视野，依次检查每个测量通道，通过调节通道偏移量确保染色可见且图像聚焦清晰。
   12. 若需将数据上传至服务器以供远程分析，请勾选 在线任务 框并选择相应的屏幕名称，此操作将在成像完成后自动上传数据至服务器。
   13. 点击 保存 按钮保存检测方案。
   14. 点击顶部的 运行实验 选项卡，命名实验板，然后点击 开始。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 锥形离心管	Falcon	352096	用于细胞离心
2-20 µL、20-200 µL、100-1000 µL 单通道移液器
含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液	Alfa Aesar	J61899	用于细胞固定
6 孔板，组织培养处理
AggreWell-800 24 孔板	STEMCELL Technologies	34815	微孔低黏附 24 孔板，用于类胚体形成
自动细胞计数仪
台式离心机
台式微量离心机
CellCarrier-96 超微孔板，组织培养处理，黑色，96 孔带盖	Perkin Elmer	6055302	96 孔组织培养（TC）处理微孔板，孔壁为黑色，底部光学透明，用于吞噬作用检测
CellProfiler 软件			开源软件，用于分析活细胞延时显微镜获得的吞噬作用图像。可从网站免费下载（http://cellprofiler.org/），本方案使用版本 2.2.0。
CellTracker Deep Red 染料	Thermo Fisher	C34565	深红色荧光、细胞通透性、琥珀酰亚胺酯反应性染料，用于标记 iPS 巨噬细胞的细胞质。将 CellTracker Deep Red 染料溶于 DMSO 至 2 mM（1.4 mg/mL）。使用时用巨噬细胞培养基将 DMSO 储液稀释至 1 μM。
II 级层流空气安全柜
CO2 气瓶			EVOS FL Auto 的配件
CO2 培养箱，设定为 37°C 和 5% CO2
细胞松弛素 D	Cayman	11330	吞噬作用检测的阴性对照处理试剂。用 DMSO 重悬至 10 mM，分装后于 -20°C 保存，避免反复冻融。使用终浓度为 10 µM。
DMEM/F12	Gibco	11320074	SH-SY5Y 培养基的组分
DMSO	Sigma	D8418	CellTracker 和 pHrodo 染料的溶剂
胎牛血清	Sigma	F4135	SH-SY5Y 培养基的组分
Geltrex LDEV-Free、hESC 认证、低生长因子基底膜基质	Invitrogen	A1413302	经 hESC 认证的基底膜基质，用于 iPSC 培养
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050-038	工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分
HBSS	Lonza	BE 10-547F	Hank’s 平衡盐溶液，用于洗涤步骤
人重组 IL-3	Gibco	PHC0033	工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分
活细胞成像溶液	Thermo Fisher	A14291DJ	无酚红 HEPES 缓冲培养基，用于标记死亡的 SH-SY5Y 细胞
低蛋白吸附 2 mL 管	Eppendorf	30108.132	用于 SH-SY5Y 细胞染色
M-CSF	Thermo Fisher	PHC9501	工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分
mTeSR1 培养基	STEMCELL Technologies	85850	iPSC 培养基
多通道 20-200 μL 移液器			用于 96 孔板液体操作
NucBlue Live ReadyProbes 试剂	Thermo Fisher	R37605	含 Hoechst 33342 的滴瓶装制剂，用于标记 iPS 巨噬细胞的细胞核，使用时在巨噬细胞培养基中加入 0.5 滴/mL。
Opera Phenix 高内涵筛选系统	Perkin Elmer	HH14000000	高内涵成像显微镜，配合 Harmony 软件版本 4.9 使用。
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	工厂培养基、巨噬细胞培养基和 SH-SY5Y 培养基的共同组分
pHrodo iFL Red STP-酯	Thermo Fisher	P36011	pH 敏感性红色荧光染料，用于标记死亡的 SH-SY5Y 细胞。将 pHrodo iFL Red STP 酯粉末溶于 DMSO 至 5 mg/mL 浓度。每 100 万个 SH-SY5Y 细胞，向预热的、悬浮于活细胞成像溶液中的细胞中加入 2.5 μL（12.5 μg）pHrodo iFL Red STP 酯储备液。
血清移液管吸头
T175 培养瓶，组织培养处理			用于 iPSC 巨噬细胞前体（称为 "工厂"）的分化
T75 培养瓶			用于 SH-SY5Y 细胞培养
透明板封膜	Greiner Bio-One	676001	用于检测板的储存和运输
水浴锅，设定为 37°C
X-VIVO 15 培养基，含 L-谷氨酰胺、庆大霉素和酚红	Lonza	BE04-418F	工厂培养基和巨噬细胞培养基的组分
X-VIVO 15 培养基，含 L-谷氨酰胺；不含庆大霉素和酚红	Lonza	04-744Q	无酚红巨噬细胞培养基，用于不含添加剂或生长因子的吞噬作用实验