小胶质细胞吞噬作用检测：利用iPSC来源的巨噬细胞建立针对神经母细胞瘤细胞的体外小胶质细胞吞噬模型

摘要

来源：Hall-Roberts, H. 等 利用iPSC来源巨噬细胞体外定量成像检测吞噬死亡神经母细胞瘤细胞的实验方法. J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们利用诱导性多能干细胞对神经母细胞瘤进行小胶质细胞吞噬功能检测。该检测有助于评估神经退行性疾病中小胶质细胞功能的损伤情况。

方案

1. 使用pH敏感性红色荧光染料标记死亡的SH-SY5Y细胞

1. 从悬浮在无酚红 HEPES 缓冲培养基中的固定 SH-SY5Y 细胞开始。计数细胞，并将所需总数的细胞转移至一个 2 mL 低蛋白结合力离心管中。每 100 万个 SH-SY5Y 细胞，将 2 mL 管中的总体积调整至 300–500 µL 酚红-free HEPES 缓冲液。在 37℃ 下短暂预热管子 °C 水浴
2. 将pH敏感性红色荧光染料STP酯重悬（参见 材料表）并加入12.5 µ将染料按每百万个SH-SY5Y细胞加入适量克数至含有2 mL细胞的预热离心管中。用移液器轻轻混匀。室温避光孵育30分钟。    
   注意： pH敏感性染料的STP酯形式可与伯胺发生反应，因此标记缓冲液中不得含有游离胺。由于该染料在水相缓冲液中溶解度可能有限，应将溶于DMSO的染料仅加入温热的水相缓冲液中，立即混匀，并观察是否有沉淀产生（在光学显微镜下可见暗色颗粒）。
3. 加入 1 mL HBSS，以 1200 x g 4℃下7分钟 °C. 弃去上清液，加入 2 mL HBSS 洗涤。重复离心步骤。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于不含酚红的巨噬细胞培养基中（参见 

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 锥形离心管	Falcon	352096	用于细胞离心
2-20 µL、20-200 µL、100-1000 µL 单通道移液器
含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液	Alfa Aesar	J61899	用于细胞固定
6 孔板，组织培养处理
AggreWell-800 24 孔板	STEMCELL Technologies	34815	微孔低黏附 24 孔板，用于类胚体形成
自动细胞计数仪
台式离心机
台式微量离心机
CellCarrier-96 超微孔板，组织培养处理，黑色，96 孔带盖	Perkin Elmer	6055302	96 孔组织培养（TC）处理微孔板，孔壁为黑色，底部光学透明，用于吞噬作用检测
CellProfiler 软件			开源软件，用于分析活细胞延时显微镜获得的吞噬作用图像。可从网站免费下载（http://cellprofiler.org/），本方案使用版本 2.2.0。
CellTracker Deep Red 染料	Thermo Fisher	C34565	深红色荧光、细胞通透性、琥珀酰亚胺酯反应性染料，用于标记 iPS 巨噬细胞的细胞质。将 CellTracker Deep Red 染料溶于 DMSO 至 2 mM（1.4 mg/mL）。使用时用巨噬细胞培养基将 DMSO 储液稀释至 1 μM。
II 级层流空气安全柜
CO2 气瓶			EVOS FL Auto 的配件
CO2 培养箱，设定为 37°C 和 5% CO2
细胞松弛素 D	Cayman	11330	吞噬作用检测的阴性对照处理试剂。用 DMSO 重悬至 10 mM，分装后于 -20°C 保存，避免反复冻融。使用终浓度为 10 µM。
DMEM/F12	Gibco	11320074	SH-SY5Y 培养基的组分
DMSO	Sigma	D8418	CellTracker 和 pHrodo 染料的溶剂
胎牛血清	Sigma	F4135	SH-SY5Y 培养基的组分
Geltrex LDEV-Free、hESC 认证、低生长因子基底膜基质	Invitrogen	A1413302	经 hESC 认证的基底膜基质，用于 iPSC 培养
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050-038	工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分
HBSS	Lonza	BE 10-547F	Hank’s 平衡盐溶液，用于洗涤步骤
人重组 IL-3	Gibco	PHC0033	工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分
活细胞成像溶液	Thermo Fisher	A14291DJ	无酚红 HEPES 缓冲培养基，用于标记死亡的 SH-SY5Y 细胞
低蛋白吸附 2 mL 管	Eppendorf	30108.132	用于 SH-SY5Y 细胞染色
M-CSF	Thermo Fisher	PHC9501	工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分
mTeSR1 培养基	STEMCELL Technologies	85850	iPSC 培养基
多通道 20-200 μL 移液器			用于 96 孔板液体操作
NucBlue Live ReadyProbes 试剂	Thermo Fisher	R37605	含 Hoechst 33342 的滴瓶装制剂，用于标记 iPS 巨噬细胞的细胞核，使用时在巨噬细胞培养基中加入 0.5 滴/mL。
Opera Phenix 高内涵筛选系统	Perkin Elmer	HH14000000	高内涵成像显微镜，配合 Harmony 软件版本 4.9 使用。
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	工厂培养基、巨噬细胞培养基和 SH-SY5Y 培养基的共同组分
pHrodo iFL Red STP-酯	Thermo Fisher	P36011	pH 敏感性红色荧光染料，用于标记死亡的 SH-SY5Y 细胞。将 pHrodo iFL Red STP 酯粉末溶于 DMSO 至 5 mg/mL 浓度。每 100 万个 SH-SY5Y 细胞，向预热的、悬浮于活细胞成像溶液中的细胞中加入 2.5 μL（12.5 μg）pHrodo iFL Red STP 酯储备液。
血清移液管吸头
T175 培养瓶，组织培养处理			用于 iPSC 巨噬细胞前体（称为 "工厂"）的分化
T75 培养瓶			用于 SH-SY5Y 细胞培养
透明板封膜	Greiner Bio-One	676001	用于检测板的储存和运输
水浴锅，设定为 37°C
X-VIVO 15 培养基，含 L-谷氨酰胺、庆大霉素和酚红	Lonza	BE04-418F	工厂培养基和巨噬细胞培养基的组分
X-VIVO 15 培养基，含 L-谷氨酰胺；不含庆大霉素和酚红	Lonza	04-744Q	无酚红巨噬细胞培养基，用于不含添加剂或生长因子的吞噬作用实验