从新鲜冷冻胶质瘤组织中分离细胞核：一种获取完整胶质瘤肿瘤样本细胞核的方法

摘要

来源：Narayanan, A. 等. 从新鲜冷冻脑肿瘤中分离细胞核用于单细胞核RNA测序和ATAC测序。J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单细胞核的实验方案。所分离的单细胞核可作为测序技术的样本，例如单细胞核RNA（snRNA）测序和单细胞核转座酶可及染色质分析（snATAC）测序，以深入研究中枢神经系统胶质瘤中所观察到的肿瘤间和肿瘤内异质性。

方案

1. 组织解剖与解离

1. 将新鲜冷冻组织样本（10–60 mg）转移至预冷的培养皿中。在冰上用剃须刀片将新鲜冷冻组织切成小块。
2. 向预冷的1.5 mL离心管中加入500 μL预冷的细胞核裂解缓冲液。将组织小块放入含有细胞核裂解缓冲液的1.5 mL离心管中，并转移至Douncer匀浆器（材料表）。
   注意：Dounce匀浆器配有两种研杵：“松”或“A”型研杵用于初步破碎样本，“紧”或“B”型研杵用于完全匀浆化样本。
3. 使用“松”型研杵匀浆组织约20次，直至摩擦阻力减小。若存在碎片，可用100 μm滤网过滤预清除样本。
4. 使用“紧”型研杵再匀浆20次，以实现组织的完全匀浆化。
5. 将匀浆液（约500 μL）转移至预冷的2 mL离心管中。加入1 mL预冷裂解缓冲液，轻轻混匀后冰上孵育5分钟。孵育期间使用宽口移液枪头轻柔混匀1–2次。
6. 使用30 μm滤网将整个匀浆液过滤，收集至15 mL Falcon管中，再转移回新的预冷2 mL离心管中。通常一个滤网即可完成全部匀浆液的过滤。
7. 在光学显微镜下检查，确认大块碎片已被去除且细胞核膜完整。细胞核应呈圆形，核膜不应变形。若仍有碎片，可对细胞核再次过滤。
8. 在台式离心机中以500 × g、4 °C离心5分钟。弃去上清液，保留约50 μL液体及含有细胞核的沉淀。将沉淀轻柔重悬于另1 mL细胞核裂解缓冲液中，冰上孵育5分钟。
9. 以500 × g、4 °C离心5分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀，加入500 μL 1x匀浆缓冲液（HB）（表1），冰上孵育5分钟，期间不重悬。随后将细胞核重悬于另1.0 mL 1x HB中。
10. 以500 × g、4 °C离心5分钟。弃去上清液，将细胞核轻柔重悬于200 μL 1x HB中，并转移至新的2.0 mL离心管。

    表1：1x匀浆缓冲液不稳定溶液的配制（每样本2 mL）

    1x匀浆缓冲液不稳定溶液（每样本2 mL）
    试剂	终浓度	每样本体积（μL）
    6x匀浆缓冲液不稳定溶液	1x	333.33
    1 M蔗糖	320 mM	640.00
    50 mM EDTA	0.1 mM	4.00
    10% NP40	0.1%	20.00
    H2O		1006.27

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma	M6250
CaCl2	Sigma	21115-100ML
EDTA (0.5 M)	Thermo Scientific	R1021
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	352096
MACS SmartStrainers（100 µm）	Miltenyi Biotec	130-098-463
Mg(Ac)2	Sigma	63052-100ML
NP-40	Abcam	ab142227
细胞核分离试剂盒：Nuclei EZ Prep	Sigma	NUC101-1KT
安全锁扣离心管 1.5 mL	Eppendorf	30120086
安全锁扣离心管 2.0 mL	Eppendorf	30120094
蔗糖	Sigma	S0389
宽口移液器吸头（1000 µL）	Thermo Fisher Scientific	2079GPK