基于梯度离心的细胞核纯化：利用密度梯度离心获取完整细胞核超纯组分的技术 密度梯度离心, 细胞核纯化, 超纯细胞核, 完整细胞核, 分离技术, 细胞组分分离, 生物化学方法, 分子生物学技术

摘要

来源：Narayanan, A. 等. 新鲜冷冻脑肿瘤样本中细胞核的分离用于单细胞核RNA测序和ATAC测序。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们介绍一种利用梯度离心法分离单个细胞核的简单高效方案。分离得到的细胞核可用于测序和基因组分析。

方案

1. 密度梯度离心

1. 加入 200 µL 的 50% 碘克沙醇溶液（表 1），使碘克沙醇的终浓度为 25%。用移液器在 300 mL 档位反复吹打 10 次，充分混匀。
2. 在 25% 混合液下方加入 300 µL 的 29% 碘克沙醇溶液（表 2）。使用 P1000 细尖移液枪，避免各层混合。
3. 在 29% 混合液下方加入 300 µL 的 35% 碘克沙醇溶液（表 3）。使用 P1000 细尖移液枪，避免各层混合。
   注意： 此步骤在移液过程中需逐步缓慢退出移液枪尖，以避免产生过大的体积位移。
4. 将样品放入水平转子离心机中，在 4°C 条件下以 3,500 x g 离心 20 分钟，关闭刹车。
5. 轻柔取出样品，避免振荡，并在光线下观察。在第二层与第三层之间应可见一条清晰的白色条带，其中含有纯度达 95% 的细胞核（图 1）。

2. 细胞核的分离

1. 吸去上层液体，直至留下位于29%–35%界面处的白色细胞核条带。
2. 收集细胞核条带，总体积为200 mL，转移至新离心管中，并使用20 µm滤膜过滤（材料表）。
   注意： 过滤前无需重悬细胞核。
3. 在光学显微镜下检查，确认已去除大块碎片且核膜完整。细胞核应呈圆形，核膜不应出现变形。
4. 使用台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数细胞核，并分装用于单核RNA测序（snRNA-seq）或单核ATAC测序（snATAC-seq）。

表1：6x 匀浆缓冲液稳定母液的配制

6倍匀浆缓冲液稳定母液混合液
试剂	终浓度	配制100 mL所需体积（mL）
1 M CaCl₂	30 mM	3.0
1 M Mg(Ac)₂	18 mM	1.8
1 M Tris pH 7.8	60 mM	6.0
H₂O		89.2
室温保存，避免直接暴露于光线下

表2：1 M 蔗糖的配制

1 M 蔗糖

34.23 g 蔗糖

溶于 78.5 mL 水中

加水定容至 100 mL

表3：6x 匀浆缓冲液不稳定溶液的配制（每样本 650 µL）

6倍均质化缓冲液不稳定溶液（每样品650 mL）
试剂	终浓度	每样品体积（µL）
6x Homogenization Buffer Stable	6x	648.84
100 mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride)	0.1 mM	1.08
14.3 M β-mercaptoethanol	1 mM	0.08

结果

图1：细胞核分离流程图。该流程图简要概述了从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单个细胞核所涉及的步骤。图中展示了肿瘤样本及碘克沙醇/蔗糖梯度离心后细胞核条带（以红色虚线圈出）的代表性图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EDTA (0.5 M)	Thermo Scientific	R1021
Falcon 15 mL 圆锥形离心管<br/> 管	Fisher Scientific	352096
碘克沙醇（又称 Optiprep）	Stem cell technologies	07820
NP-40	Abcam	ab142227
安全锁扣管 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
安全锁扣管 2.0 mL	Eppendorf	0030120094
蔗糖	Sigma	S0389
宽口移液器吸头 (1000 &micro;L)	Thermo Fisher Scientific	2079GPK
宽口移液器吸头 (200 &micro;L)	Thermo Fisher Scientific	2069GPK