冷冻组织切片的固定与染色：一种用于激光显微切割的冻脑组织切片处理方法

摘要

来源：Comba, A. 等. 胶质瘤亚区域的激光捕获显微切割，用于肿瘤内异质性、肿瘤微流和侵袭的空间与分子表征 J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了处理小鼠冷冻脑肿瘤组织的固定与染色方法。经处理的组织有助于在后续的激光显微切割中区分并获取特定的细胞群体。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 冷冻保存脑组织切片的固定与染色

1. 为保持 RNA 完整性，使用 RNase 去除剂清洁所有将要使用的仪器。在通风橱内进行固定和染色操作。
2. 在洁净无 RNase 的 50 mL 离心管中配制所述固定液。所有溶液均需在染色当天使用无 RNase 水配制。
3. 在进行激光显微切割的当天，配制 100%、95%、70% 和 50% 的乙醇溶液。将溶液置于密封管中，室温保存。
4. 在 75% 乙醇溶液中配制 4% 焦油紫（Cresyl violet）和 0.5% 伊红 Y（eosin Y）。剧烈涡旋振荡溶液 1 分钟，并通过 0.45 µm 尼龙滤膜过滤，以去除未溶解的粉末残留。
5. 将组织切片放入盛有 95% 乙醇的容器中，浸泡 30 秒。然后将切片转移至含有 75% 乙醇的离心管中，停留 30 秒。
6. 将切片转移至 50% 乙醇中，停留 25 秒。此时 OCT 包埋剂应已溶解。将切片转移至 4% 焦油紫溶液中染色 20 秒，随后转移至 0.5% 伊红 Y 溶液中染色 5 秒。
7. 从染液中取出切片，用滤纸轻轻吸干。然后将切片放入 50% 乙醇中 25 秒，再转移至 75% 乙醇中 25 秒，接着转移至 95% 乙醇中 30 秒，最后转移至 100% 乙醇中 60 秒。
8. 用二甲苯冲洗切片。将切片转移至盛有二甲苯的容器中，静置 3 分钟。
9. 在无 RNase 水中配制封片介质（如 Pinpoint gum）。为封固小鼠脑切片，将封片介质按 1:10 的比例稀释于无 RNase 水中。
10. 将切片在无 RNase 的表面上室温干燥 10 秒。在二甲苯完全挥发前，立即进行切片封片操作。
11. 使用无菌且无 RNase 的细毛笔，在载玻片的组织上轻柔地涂布封片液。等待 10–20 秒后，立即将组织切片转移至显微镜激光显微切割平台。
    注意：用于封片的封片介质与无 RNase 水的比例根据目标组织的不同而有所变化。该比例可在不影响 RNA 完整性的前提下，有效维持胶质瘤组织的形态，适用于激光显微切割。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
醋酸焦油紫	Sigma Aldrich	C5042
伊红Y	Sigma Aldrich	E4009
RNA酶去污溶液RNaseZap	Fisher Scientific	AM9780
PEN膜玻片（2 µm）	Lieca	1150518
Pinpoint溶液	Zymo Research	D3001-1
组织冷冻包埋剂Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571