冷冻保存的组织切片固定和染色:一种处理冷冻脑组织切片以进行激光显微切割的程序

Abstract

来源:Comba， A. et al. 激光捕获神经胶质瘤亚区的显微解剖，用于瘤内异质性、Oncostreams 和侵袭的空间和分子表征。J. Vis. Exp.（2020 年）

本视频介绍了处理冷冻小鼠脑肿瘤组织的固定和染色方法。处理过的组织有助于在随后的激光捕获显微切割过程中分化并获得特定的细胞群。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 冻存脑组织切片的固定和染色

1. 为了保持 RNA 完整性，请清洁所有使用 RNase 清洁液的仪器。在通风橱内进行固定和染色方案。
2. 在干净的不含 RNase 的 50 mL 试管中制备所述固定液。在染色当天用不含 RNase 的水制备所有溶液。
3. 进行激光显微切割的同一天，准备 100%、95%、70% 和 50% 乙醇溶液。在室温下将溶液保存在密闭的试管中。
4. 在 75% 乙醇溶液中制备 4% 甲酚紫和 0.5% 伊红 Y。将溶液剧烈涡旋 1 分钟，然后通过 0.45 μm 尼龙过滤器过滤，以消除微量未溶解的粉末。
5. 将组织载玻片放入含有 95% 乙醇的容器中 30 秒。将载玻片转移到含有 75% 乙醇的试管中;将载玻片放置 30 秒。
6. 将载玻片转移到 50% 乙醇中并放置 25 秒。此时，OCT 将被解散。将载玻片转移到 4% 甲酚紫溶液中 20 秒，然后转移到 0.5% 伊红 Y 溶液中 5 秒。
7. 从染料溶液中取出载玻片，用滤纸吸干载玻片。然后，将载玻片放入 50% 乙醇中 25 秒。将载玻片转移到 75% 乙醇中 25 秒。将载玻片转移到 95% 乙醇中 30 秒。将载玻片转移到 100% 乙醇中 60 秒。
8. 用二甲苯冲洗载玻片。将它们转移到装有二甲苯的容器中并等待 3 分钟。
9. 在不含 RNase 的水中制备封固剂（例如，Pinpoint 胶）。要封片小鼠脑切片，请在不含 RNase 的水中以 1:10 的比例稀释封片剂。
10. 在室温下将载玻片在无 RNase 的表面上干燥 10 秒。在二甲苯干燥之前，继续用组织切片安装载玻片。
11. 用无菌且不含 RNase 的薄画笔将安装溶液轻轻分散在载玻片上的组织顶部。等待 10-20 秒，然后立即将组织载玻片转移到显微镜显微切割平台上。
    注:用于封片的封片剂与不含 RNase 的水的比例因目标组织而异。封固剂/水的比例保留了神经胶质瘤组织形态，用于激光显微切割，而不会影响 RNA 的完整性。

Materials