从小鼠脑中分离单核细胞：一种通过密度梯度离心法分离脑内常驻单核细胞的技术

摘要

来源：Ji, Z. 等. 实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析. J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们通过密度梯度离心法从小鼠大脑中分离单个核细胞。所获得的单个核细胞悬液可用于后续下游分析。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 脑组织单细胞悬液的制备

1. 在15 mL锥形管中，将密度梯度介质与PBS按9:1比例稀释，得到终浓度为100%的溶液。
2. 在EAE高峰期，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉小鼠，并用20 mL无菌冰浴PBS进行心脏灌注。操作时使用20 mL注射器将PBS缓慢而稳定地注入左心室，同时剪开右心房。
3. 小心地从鼻部向颈部剪开颅骨，将脑组织从颅腔中取出，放入含10 mL RPMI的50 mL锥形管中。充分混匀以去除黏附的红细胞，然后用抽吸法移除上清液，并加入10 mL RPMI。
4. 将脑组织和培养基转移至100 mm培养皿中，用刀片精细切碎。
5. 用洁净的移液管从培养皿中转移6 mL组织悬液至冰浴预冷的7 mL烧结玻璃匀浆器中。避免在移液管中残留大量组织，少量残留不可避免。
6. 先使用“松”活塞的研杵研磨脑组织，再换用“紧”活塞，直至悬液均匀，然后将其倒入预冷的15 mL锥形管中，并置于冰上保存。
7. 待所有样品匀浆完成后，估算体积，并用RPMI调整至7 mL。随后，在预冷的15 mL离心管中加入3 mL冰浴预冷的100%基底膜基质，再加入7 mL脑匀浆液，得到终浓度为30%的密度梯度介质。轻轻颠倒混匀数次，切勿涡旋。
8. 为确保界面清晰，用3 mL移液管小心缓慢地加入1 mL 70% RPMI稀释的底层密度梯度介质。
9. 在4 °C条件下，以800 × g 离心20分钟。设置加速度为1，减速度为0。离心后，小心抽吸几乎全部上层相，彻底去除顶部的髓鞘成分（图1）。
10. 收集界面层至新的15 mL离心管中，用RPMI调整体积至10 mL。
11. 以500 × g 离心10分钟，离心后弃去上清液，将沉淀重悬于约200 μL流式细胞术染色（FSC）缓冲液中。

结果

图 1：Percoll 梯度法分离单个核细胞的示意图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
达恩斯匀浆器	Wheaton	353107542
佩可溶液	GE	17-0891-01