从小鼠脑中分离单核细胞:一种分离脑驻留单核细胞的密度梯度离心技术

Abstract

来源:Ji， Z. et al. 实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析。J. Vis. Exp. （2020 年）

在本视频中，我们使用密度梯度离心法从小鼠的大脑中分离单核细胞。分离的单核细胞悬液可用于进一步的下游分析。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 来自大脑的单细胞悬液制备

在
1. 15 mL 锥形管中用 PBS 以 9:1 的比例稀释密度梯度培养基，以产生最终的 100% 溶液。
2. 通过腹膜内注射 1% 戊巴比妥钠 （50 mg/kg） 麻醉 EAE 峰值的小鼠，并用 20 mL 无菌冰冷的 PBS 心内灌注。通过使用 20 mL 注射器将 PBS 缓慢稳定地注射到心脏的左心室并打开右心房来实现这一点。
3. 从鼻子到颈部小心地切开颅骨，然后将大脑从颅盒中取出，放入 10 mL 锥形管中的 50 mL RPMI 中。充分混合以去除粘附的红细胞。然后，通过抽吸去除培养基并加入 10 mL RPMI。
4. 将脑和培养基放入 100 mm 培养皿中。用剃须刀片切碎。
5. 用干净的移液管将 6 mL 从培养皿中转移到冰冷的 7 mL 烧结玻璃匀浆器中。避免在移液器中留下大量组织。少量是不可避免的。
6. 先用研杵的 "松散 "柱塞研磨大脑，然后使用 "紧 "柱塞，直到悬浮液均匀，倒入预冷的 15 mL 锥形管中并保持在冰上。
7. 所有样品均质化后，估计体积。使用 RPMI 将体积调节至 7 mL。然后，将 3 mL 冰冷的 100% 基底膜基质放入冷冻的 15 mL 锥形离心管中，并加入 7 mL 脑匀浆以产生最终的 30% 密度梯度培养基。倒置混合几次。不要涡旋。
8. 为确保界面清晰，用 3 mL 移液器在 RPMI 中小心缓慢地加入 1 mL 70% 底层密度梯度培养基。
9. 在 4 °C 下以 800 x g 离心仅 20 分钟。将加速度设置为 1，将减速设置为 0。离心后，吸出几乎所有的顶部相，小心地完全去除顶部的髓鞘（图 1）。
10. 将接口拆下到新的 15 离心管中。使用 RPMI 将体积调节至 10 mL。
11. 以 500 x g 离心 10 分钟。离心后，吸出上清液。将沉淀重悬于 ~200 μL 流式细胞术染色 （FSC） 缓冲液中。

Results

图 1:用于分离单核细胞的 Percoll 梯度设置示意图。

Materials