基于免疫亲和的泛素化肽段提取：一种从纯化肽段组分中选择性提取泛素标记肽段的技术

摘要

来源：Bezstarosti, K. 等。通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点。 J. Vis. Exp. （2020）

本视频介绍了一种从复杂的肽混合物中提取并纯化含有甘氨酸残基二肽片段的泛素化肽的方法。该方法有助于鉴定蛋白质中原始的泛素化位点。

方案

1. 泛素化肽段的提取

1. 使用高pH反相（RP）C18色谱柱，装填聚合物固定相材料（300 Å，50 µM；参见材料表），装入空柱芯中以分离胰蛋白酶消化后的肽段。固定相填料的用量需根据待分离蛋白质消化产物的量进行调整。准备一个空的6 mL柱芯（参见材料表），装入0.5 g固定相材料，适用于约10 mg蛋白质消化产物。蛋白质消化产物与固定相的质量比应约为1:50（w/w）。
2. 将肽段上样至已准备好的柱子，并用约10倍柱体积的0.1%三氟乙酸（TFA）洗涤柱子，随后用约10倍柱体积的H₂O冲洗。
3. 用10倍柱体积的10 mM甲酸铵溶液（pH = 10），分别含7%、13.5%和50%乙腈（AcN），将肽段洗脱为三个组分。将所有组分完全冻干。
4. 使用与蛋白A琼脂糖微珠偶联的泛素残基基序（K-ε-GG）抗体，对二甘氨酸（diGly）肽段进行免疫富集。由于每批微珠所含抗体的确切量属于制造商的专有信息且未公开，建议采用与制造商相同的“一批”定义，以避免混淆。用PBS将一批微珠洗涤2次，并将微珠悬液均分为六等份。详细实验方案见图1。
5. 将步骤1.3中收集的三个肽段组分溶解于1.4 mL缓冲液中，缓冲液组成为50 mM MOPS、10 mM磷酸钠和50 mM NaCl（pH = 7.2），离心去除不溶物。
6. 将各组分的上清液加入diGly抗体微珠中，在4 °C下旋转孵育2小时。离心收集微珠后，将上清液转移至新的一批抗体微珠中，再次在4 °C下孵育2小时。
7. 将上清液保存，用于后续全蛋白质组（GP）分析。
8. 将各组分中的微珠转移至装有GF/F滤芯的200 µL移液枪头中，以保留微珠。将装有微珠的枪头插入配有离心适配器的1.5 mL微量离心管中。用200 µL冰浴IAP缓冲液洗涤微珠3次，再用200 µL冰浴Milli-Q H₂O洗涤3次。每次洗涤前以200 × g离心2分钟，注意避免柱子干涸。使用2次50 µL的0.15% TFA洗脱肽段。
9. 使用C18阶段枪头（本质上是装有两个C18圆盘的200 µL移液枪头）对肽段进行脱盐处理，并通过真空离心完全干燥。

结果

图1：实验概述。 (A) 实验方法的总体流程。样品经制备后进行胰蛋白酶消化，并通过高pH反相色谱分离为三个组分。将一批商用α-diGly肽抗体磁珠均分为六份，三个肽段组分分别加载至其中三份磁珠上。diGly肽经免疫富集、洗脱并收集，流穿部分随后转移至剩余的三份新鲜磁珠组分中进行二次富集。收集的diGly肽采用Lumos Orbitrap质谱仪进行质谱分析，分析方案采用两层级策略：第一周期优先选择信号最强的峰进行肽段碎裂，第二周期则优先选择信号最弱的峰进行碎裂。全部nLC-MS/MS数据运行结果随后使用MaxQuant软件进行分析。(B) 其中一个组分应包含泛素自身K48位点修饰的胰蛋白酶消化diGly肽LIFAGK(GG)QLEDGR（m/z 730.39）。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
赖氨酰内肽酶（Lysyl Endopeptidase, LysC）	和光纯药工业（Wako Pure Chemicals）	129-02541
纳流液相色谱柱温箱（NanoLC oven）	MPI设计，MS Wil GmbH
N-月桂酰肌氨酸钠盐（N-Lauroylsarcosine sodium salt）	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪<br/>	赛默飞世尔科技（ThermoFisher）
PLRP-S（300 &Aring;, 50 &micro;m）聚合物反相填料<br/>	安捷伦科技（Agilent Technologies）	PL1412-2K01
PTMScan 泛素化残基基序<br/>（K-&epsilon;-GG）试剂盒	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc 真空固相萃取小柱（Vac Cartridge）	沃特世（Waters）	WAT036790	在用 PLRP-S 填料填充小柱前，需将 tC18 填料从<br/>小柱中移除<br/>
脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate）	Sigma-Aldrich	30970
Tris碱（Tris-base）	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
经TPCK处理的胰蛋白酶（Trypsin, TPCK Treated）	赛默飞世尔科技（ThermoFisher）	20233