基于免疫亲和的泛素化肽提取:一种从纯化的肽组分中选择性提取泛素标记肽的技术

摘要

来源:Bezstarosti， K. et al. 通过肽富集和质谱法检测蛋白质泛素化位点。J. Vis. Exp. （2020 年）

该视频介绍了一种从复杂肽混合物中提取和纯化含有残余二甘氨酸肽的泛素化肽的方法。所提出的方法可能有助于识别蛋白质中的原始泛素化位点。

方案

1. 泛素化肽的提取

1. 使用高 pH 值反相 （RP） C18 色谱法，将聚合物固定相材料（300 Å，50 μM;参见材料表）加载到空柱柱柱中，以分离胰蛋白酶肽。固定相柱床尺寸必须根据要分级分离的蛋白质消化物的量进行调整。准备一个空的 6 mL 柱柱柱（参见材料表），其中填充了 0.5 g 固定相材料，用于 ~10 mg 蛋白质消化物。蛋白质消化物与固定相的比率应约为 1:50 （w/w）。
2. 将肽加载到制备好的色谱柱上，用大约 10 倍柱体积的 0.1% TFA 洗涤色谱柱，然后用大约 10 倍柱体积的 H 2 O 洗涤色谱柱。
3. 用 10 倍柱体积的 10 mM 甲酸铵溶液 （pH = 10），分别含 7%、13.5% 和 50% 乙腈 （AcN），将肽洗脱成三个馏分。将所有组分冻干至完全。
4. 使用与蛋白 A 琼脂糖珠偶联的泛素残余基序 （K-ε-GG） 抗体对 diGly 肽进行免疫富集。由于每批磁珠的确切抗体量是专有信息，制造商未披露，因此建议对一批磁珠使用与制造商相同的定义，以避免混淆。用 PBS 洗涤一批这些珠子 2 次，并将珠子浆液分成六个相等的馏分。有关详细的实验方案，请参见图 1。
将
5. 步骤 1.3 中收集的三种肽组分溶解在 1.4 mL 由 50 mM MOPS、10 mM 磷酸钠和 50 mM NaCl （pH = 7.2） 组成的缓冲液中，然后离心碎片。
6. 将级分的上清液加入 diGly 抗体珠中，并在 4 °C 下在旋转器单元上孵育 2 小时。旋转珠子，将上清液转移到新批次的抗体珠子中，并在 4 °C 下再次孵育 2 小时。
7. 储存上清液用于随后的全局蛋白质组 （GP） 分析。
8. 将每个馏分中的磁珠转移到配备有 GF/F 过滤塞的 200 μL 移液器吸头中，以保留磁珠。将带有磁珠的移液器吸头放入配备有离心吸头适配器的 1.5 mL 微量离心管中。用 200 μL 冰冷的 IAP 缓冲液洗涤珠子 3 次，然后用 200 μL 冰冷的 Milli-Q_{H 2}O 洗涤 3 次。在每个洗涤步骤之前，以 200 x g 的速度将色谱柱旋转 2 分钟，但注意不要让色谱柱干涸。使用 50 μL 0.15% TFA 的 2 个循环洗脱肽。
9. 使用 C18 阶段吸头（本质上是带有两个 C18 盘的 200 μL 移液器吸头）对肽进行脱盐，并使用真空离心将其干燥至完全。

结果

图 1:实验概述。（A） 实验方法概述。制备样品，用胰蛋白酶消化，并使用高 pH 值洗脱的反相色谱法将样品分离成三个组分。将一批市售 α-diGly 肽抗体珠子分成 6 个相等的馏分，然后将 3 个肽段分加载到其中 3 个珠子组分上。对 diGly 肽进行免疫纯化、洗脱和收集，随后将流出液转移到剩余的三个新鲜微珠组分中。在 Lumos Orbitrap 质谱仪上通过质谱分析收集的 diGly 肽，根据两层方案进行分析，该方案结合了一个循环，其中首先选择最强的峰进行肽碎裂，下一个循环首先选择强度最低的峰。然后使用 MaxQuant 分析完整的 nLC-MS/MS 运行集。（B） 其中一个馏分应包含泛素自身的 K48 修饰胰蛋白酶 diGly 肽 LIFAGK（GG）QLEDGR （m/z 730.39）。这是迄今为止免疫沉淀馏分中丰度最高的肽，其特征是在 120 min 梯度下，液相色谱图在 50–55 min 之间出现强烈而宽的峰。如果色谱图中...

材料