DNA合成检测：利用放射性氚标记胸腺嘧啶掺入法评估增殖细胞中DNA合成的技术

摘要

来源：Williams, M. 等. 人神经前体细胞（NPCs）中神经发育表型的快速检测. J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们通过检测放射性示踪剂氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入细胞DNA的情况，来测定神经前体细胞的增殖能力。该技术可用于研究特定药物和生长因子处理后细胞的增殖情况。

方案

1. 神经前体细胞的维持

1. 将NPC以每孔150万个细胞的密度接种至含有2 mL 100%扩增培养基的ECM模拟凝胶包被孔中。
2. 将NPC在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育。
3. 对于P3代或更低代次的NPC，或解冻后的NPC，向培养基中添加5 μM的ROCK抑制剂，以防止细胞过度死亡。24小时后更换培养基以去除ROCK抑制剂。
4. 每4–9天传代一次细胞，具体时间取决于细胞达到融合状态的时机。当细胞形成致密的单层并完全覆盖培养皿底部表面时，即视为融合。
5. 将NPC以每6孔板一孔100万至150万个细胞的密度接种。每48小时更换一次耗尽的培养基，并加入2 mL 100%扩增培养基。

3. 神经前体细胞DNA合成检测

1. 在24孔板中每孔接种100,000个细胞，每种条件设三个复孔进行检测。
2. 培养46小时后，向每孔培养基中加入放射性氚标记的[³H]-胸腺嘧啶核苷（1.5 μCi/mL）。于37 °C孵育2小时。
   注意：使用放射性物质时，须接受所在机构的培训，遵守放射性安全操作规程，并将放射性废弃物置于指定的专用容器中妥善处理。
3. 孵育2小时后，移除放射性培养基并按规范处置。每孔加入300 μL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA（0.5 mM），于37 °C孵育20分钟。
4. 开启细胞收集仪（见材料部分）及泵，确保泵压低于200 PSI。将滤纸穿过细胞收集仪的插槽，并撕去右上角以标记滤纸方向。
5. 将细胞收集仪的收集管放入空的“空白” 托盘中，按下预洗键以润湿滤纸。随后将收集管插入样品孔中，运行（启动）程序。
6. 当细胞收集仪完成样品收集后，抬起夹具，推进滤纸，对所有样品组重复此操作。预洗步骤始终应在空的“空白” 板中进行。
7. 在光源下干燥滤纸，将对应的小瓶放入托盘中。用打孔器将滤纸圆片打下并落入小瓶中，每瓶加入2 mL液体闪烁液。盖紧瓶盖并对小瓶进行标记。
8. 将小瓶在液体闪烁液中孵育至少1小时，然后使用闪烁计数仪测定每分钟计数（CPMs）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高级DMEM/F12培养基	ThermoFischer Scientific	12634-010	100%扩增培养基的组分
Neurobasal培养基	ThermoFischer Scientific	21103049
24孔板	ThermoFischer Scientific	2021-05	聚苯乙烯板：用于NPC DNA合成实验
天然小鼠层粘连蛋白	Invitrogen	23017-015	包被板的基质：用于NPC DNA合成、S期进入及细胞数量检测
青霉素/链霉素	ThermoFischer Scientific	15140122	抗生素，扩增培养基的组分
2.5%胰蛋白酶（10倍浓度）	Gibco	15090-046	10倍酶溶液
0.5 M EDTA	ThermoFischer Scientific	AM9261	用于胰蛋白酶溶液中以消化细胞，用于DNA合成实验
氚标记[3H]-胸腺嘧啶核苷	PerkinElmer	NET027E001	放射性氚标记的胸腺嘧啶核苷
Fisherbrand 7 mL HDPE闪烁小瓶	Fisherbrand	03-337-1	用于液体闪烁计数的小瓶
EcoLite(+)	MP Biomedicals	188247501	液体闪烁液
LS 6500多功能液体闪烁计数仪	Beckman Coulter	8043-30-1194	液体闪烁计数仪
Skatron半自动细胞收集器	Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc.	Type 11019	半自动细胞收集器
Whatman GF/C级滤纸	GE Healthcare Life Sciences	1822-849	玻璃纤维滤纸