NPC神经球实验：一种用于评估神经球中神经前体细胞迁移反应的体外实验方法

摘要

来源：Williams, M. 等 人类神经前体细胞（NPCs）中神经发育表型的快速检测。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了神经前体细胞神经球迁移实验——一种通过显微分析来研究神经球中神经前体细胞迁移反应的体外实验方法。

方案

1. NPC 神经球迁移实验

1. 神经球形成
   1. 向未包被基质的35 mm培养皿中加入1 mL 100%扩增培养基。将培养皿在37℃孵育至少15 min。 °铺板NPC前的C步骤。准备2–3个培养皿，以确保神经球数量足以进行细胞迁移实验。
      注意： 缺乏包被基质可确保神经前体细胞（NPCs）悬浮于培养基中，这对神经球的形成至关重要。包被培养皿将抑制神经球的形成。
   2. 消化、解离并离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于 2–5 mL 预热的 100% 扩增培养基中。将 100 万个神经前体细胞接种至每个已准备好的 35 mm 培养皿中 第1.1.1节.
   3. 将NPCs在37℃孵育 °在48至96小时内于C条件下培养，使神经前体细胞（NPCs）聚集并形成神经球。使用相差显微镜配合实时标尺评估神经球大小。待大多数神经球直径达到约100时进行后续操作 µ米± 20 μm) (图1较小的球体在迁移实验过程中会完全分散并解体。
2. 神经球迁移实验用培养板的制备
   1. 将ECM模拟凝胶等分试样溶解于6 mL 30%扩增培养基中。待ECM模拟凝胶/30%扩增培养基溶液配制完成后，按所需浓度加入载体、生长因子或目标药物。
      注意： 载体、药物和生长因子的浓度需要提高，以补偿200的添加量 µ神经球的L 第1.3节.
   2. 加入1 mL ECM模拟凝胶/30%扩增培养基溶液（± 载体、生长因子或药物）加入至6孔板的一个孔中。每种实验条件制备2–3个孔。也可使用35 mm培养皿。将培养板在37℃孵育至少30分钟 °C.^.
      注意： 本实验中切勿抽吸ECM模拟凝胶/30%扩增培养基溶液。若将类球体接种至经抽吸的ECM模拟凝胶上，将导致快速且过度的迁移。
3. 神经球接种培养
   1. 收集形成的神经球 第1.1节 并将它们放入一个锥形管中。用1 mL 1×PBS冲洗35 mm培养皿，以确保收集所有神经球。以100 × g离心收集的神经球 g 5 分钟。
   2. 将神经球重悬于1–3 mL预热的30%扩增培养基中。若收集自1个培养皿的神经球，则使用1 mL培养基重悬；若收集自2个培养皿，则加入2 mL培养基，依此类推。使用移液器轻柔吹打，仅使用P-1000移液器以确保神经球不被破坏。
   3. 接种 200 μ重悬的神经球中的 L 加入由 ECM 模拟凝胶/30% 扩增溶液制成的混合物中 第1.2节 轻轻晃动培养板，使神经球均匀分布。将培养板于37℃孵育48小时。°C.
   4. 去除ECM-模拟凝胶/30%扩增培养基溶液，用4%多聚甲醛固定细胞，洗涤后将细胞保存于1×PBS + 0.05%叠氮化钠中。
4. 神经球分析
   1. 使用10倍相位对比设置获取整个神经球的图像，确保神经球之间互不接触。利用ImageJ软件测量平均迁移距离。
   2. 使用自由手绘线条工具描出神经球的外轮廓。可通过右键点击“直线”图标来访问自由手绘线条工具。使用鼠标手动描迹。
   3. 使用测量功能计算轨迹的面积。确保在“分析”选项卡下的“设置测量”窗口中已选择“面积”作为输出参数。参见 图2 用于勾勒外轮廓的蓝色痕迹。
   4. 描记球体内的内细胞团并测量其面积。参见 图2 用红色标记内轮廓的痕迹。通过从神经球总体积中减去内部细胞团的面积来量化平均迁移距离。
   5. 测量具有致密内细胞团且细胞以连续铺路石样迁移的神经球（图2).
   6. 不要将菌毯之外或脱离神经球的细胞纳入测量范围。参见 图2 例如，用白色圆圈标出的细胞被排除在外层地毯测量之外。每种条件下至少分析20个神经球。

结果

图1： 迁移实验用神经球的筛选。 (A) 24小时时代表性视野下的神经球相差图像。所有球体直径均小于100 µm，因此不用于迁移实验。 (B) 72小时时代表性视野下的神经球相差图像。所有球体直径均在100 µm ± 20 µm范围内，表明其已适合用于迁移实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基 	ThermoFischer Scientific	21103049	NIM 和 100% 扩增培养基的组分
PSC 神经诱导培养基：方案链接：https://goo.gl/ euub7a	 ThermoFischer Scientific  	A1647801	该试剂盒包含 Neurobasal（NB）培养基和 50x 神经诱导补充剂（NIS）。NIS 用于配制 1X 神经诱导培养基和 100% 扩增培养基
Advanced DMEM/F12 培养基 	ThermoFischer Scientific  	12634-010	100% 扩增培养基的组分
hESC-合格的 Matrigel	Corning 	354277	适用于 hESC 的细胞外基质模拟凝胶（ECM-模拟凝胶）
6 孔板 	Corning 	COR-3506 	用于神经前体细胞维持和神经球迁移实验的聚苯乙烯板
人碱性 FGF-2 	Peprotech	100-18B 	生长因子
青霉素/链霉素 	ThermoFischer Scientific  	15140122	抗生素，NIM、100% 扩增培养基和 30% 扩增培养基的组分