来源：Schildge, S. 等. 小鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养. J. Vis. Exp. (2013)
在本视频中，我们介绍了从新生小鼠中获取纯化星形胶质细胞的方法。
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方法文章
星形胶质细胞分离：一种获取小鼠皮层星形胶质细胞纯品的方法
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 混合皮层细胞的分离与接种培养
使用出生后1至4天（P1至P4）的小鼠幼崽可进行混合皮层细胞的分离，用于星形胶质细胞培养。为获得合适的星形胶质细胞密度，每T75组织培养瓶需使用4只小鼠幼崽的皮层组织。因此，以下实验方案中的体积均基于4只小鼠幼崽的细胞制备量进行计算。
- 开始解剖操作前，将30 mL星形胶质细胞培养基（DMEM，高糖 + 10% 热灭活胎牛血清 + 1% 青霉素/链霉素；见表格）预热至37 °C。在CO2培养箱中，用20 mL浓度为50 μg/mL的多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液（溶于细胞培养级水中）包被一个T75培养瓶，37 °C孵育1小时。
- 进行解剖操作时，准备好所有必需的试剂和材料。你需要手术剪、光滑细镊、平头镊、纸巾、废液袋、70%乙醇，以及两个置于冰上的解剖皿（直径3.5 cm），每个解剖皿中加入2 mL HBSS。
- 轻轻握住幼鼠头部和颈部，并用70%乙醇喷洒。使用剪刀进行断头处死动物。
- 沿头皮从前向后做正中切口，暴露颅骨。
- 小心地从颈部向鼻部剪开颅骨。再做两个附加切口以进一步暴露脑组织：第一个切口位于嗅球前方，第二个切口位于小脑下方，以使颅骨与颅底分离。
- 使用平头镊将颅骨瓣轻轻掀向两侧，取出脑组织并放入第一个盛有HBSS的解剖皿中。将解剖皿放回冰上，并继续采集其余3个脑组织。
- 后续解剖操作在体视显微镜下进行。首先使用细解剖镊去除嗅球和小脑（图1B）。
- 为获取皮层组织，用细镊夹住脑组织后端，沿半球间做正中切口，将第二把镊子插入切开的沟槽中，将板状的皮层结构从脑组织上剥离下来。
- 使用细镊小心地从皮层半球上剥离脑膜（图1D'）。此步骤可避免脑膜细胞和成纤维细胞污染最终的星形胶质细胞培养物。将处理好的皮层半球转移至第二个盛有HBSS的解剖皿中，并放回冰上。依同样方法处理全部4个皮层。
- 最后，使用锋利刀片将每个皮层半球切成小块（约4至8次切割）。
- 在无菌条件下，将皮层组织块转移至一个50 mL Falcon离心管中，并加入HBSS至总体积为22.5 mL。
- 加入2.5 mL 2.5%胰蛋白酶溶液，混匀后于37 °C水浴中孵育30分钟。每隔10分钟轻轻摇动混合一次。
- 以300 xg离心5分钟，沉淀皮层组织块。
- 小心倾去上清液。为避免丢失组织沉淀，可用移液器机械性保留沉淀。加入10 mL星形胶质细胞接种培养基，使用10 mL塑料移液管剧烈吹打20至30次，将组织解离为单细胞悬液。用星形胶质细胞接种培养基调整终体积至20 mL。可通过血细胞计数板计数验证皮层组织是否已充分解离为单细胞。4只幼鼠皮层组织的一次制备应可获得10–15 x106个单细胞。
- 吸除T75培养瓶中的PDL溶液，接种单细胞悬液，并在CO2培养箱中37 °C孵育。
2. 获得富集的星形胶质细胞培养物
- 在混合皮层细胞接种后第2天更换培养基，此后每3天更换一次。
- 接种后7至8天，当星形胶质细胞达到汇合状态，小胶质细胞暴露于星形胶质细胞层表面或已从星形胶质细胞层脱落时（图2），将T75培养瓶置于摇床上，以180 rpm振荡30分钟，以去除小胶质细胞。弃去含有小胶质细胞的上清液；若需培养和研究小胶质细胞，可将其离心收集并接种培养。
- 加入20 mL新鲜星形胶质细胞培养基，随后将培养瓶以240 rpm振荡6小时，以去除少突胶质前体细胞（OPC）。由于部分OPC可能未完全从星形胶质细胞层脱离，需再用手剧烈振荡1分钟，以防止OPC污染。弃去上清液；若需培养OPC，可将其离心收集并接种。
- 用PBS冲洗残留的汇合星形胶质细胞层两次，吸除PBS，加入5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C的CO2培养箱中孵育。每5分钟检查一次星形胶质细胞的脱落情况，并通过将培养瓶轻击手掌2–3次促进细胞脱落。
- 待星形胶质细胞完全脱落后，加入5 mL星形胶质细胞培养基终止消化，以180 × g离心5分钟，吸除上清液，加入40 mL新鲜星形胶质细胞接种培养基。一次T75培养瓶在首次传代后应可获得约1×106个细胞。将细胞接种至两个T75培养瓶中，于37 °C的CO2培养箱中培养，每2至3天更换一次培养基。
- 首次传代后12–14天，在进行实验前24–48小时，将星形胶质细胞以适当浓度接种。一次T75培养瓶在第二次传代后应可获得约1.5–2×106个细胞。
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结果
图1. 出生后（P3）小鼠大脑皮层的解剖。A）完整脑组织。B）去除嗅球和小脑后的脑组织。C）通过将皮层的板状结构从脑组织上剥离，分离出皮层。D, D'）腹侧和背侧带有脑膜的皮层（黑色箭头指示脑膜动脉）。E）去除脑膜后的皮层。比例尺，1.5 mm。
图2. 分离后的混合皮层细胞及纯星形胶质细胞...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>星形胶质细胞培养基</strong> | |||
| DMEM高糖 | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS 热灭活 | Life Technologies | 10082-147 | 终浓度：10% |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | 终浓度：1% |
| <强>脑组织消化液</strong> | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% 胰蛋白酶 | Life Technologies | 15090-046 | 终浓度：0.25% |
| <强>其他</strong> | |||
| 70%（体积/体积）乙醇 | Roth | 9065.2 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Millipor A-003 | A-003-E | |
| 水 | 聚丙烯酸 | S15-012 | 细胞培养级 |
| PBS | PAA | H15-002 | 细胞培养级 |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 µm 无菌滤器 | 赛多利斯 | 16555 | |
| 3.5 cm 培养皿 | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon管 | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon管 | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm² 组织培养瓶 | BD Falcon | 353136 | |
| 精细镊子 | Dumont | 2-1032; 2-1033 | #3c；#5 |
| 镊子平头 | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm 外科剪刀 | Aesculap | BC-140-R | |
| 体视显微镜 | Leica | MZ7.5 | |
| 体视显微镜 + 相机 | Leica | MZ16F；DFC320 | |
| 显微镜 + 相机 | 蔡司；佳能 | Primo Vert；PowerShot A650 IS | |
| 离心 | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| 轨道摇床 | 赛默飞世尔科技 | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| 水浴锅 | Julabo | SW20；37 °C |
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