从大鼠脑微血管中分离和培养内皮细胞：一种从大鼠脑微血管中分离并培养内皮细胞的方法 关键词：内皮细胞，大鼠脑，微血管，细胞培养，血脑屏障

摘要

来源：Molino, Y. 等 建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：聚焦BBB不通透性与受体介导的转运 视频实验杂志 (2014)

本视频介绍了利用密度梯度离心结合酶消化方法从大鼠脑组织中分离微血管的技术。分离得到的微血管可在预先包被了胶原蛋白和纤连蛋白基质的培养瓶中进行培养，以获得内皮细胞克隆。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 大鼠脑微血管的分离

1. 每次制备及每位实验操作者使用3只五周龄Wistar大鼠。
2. 第一周的星期一，准备2个T75培养瓶，分别用IV型胶原和纤连蛋白包被，两者浓度均为1 µg/cm² 在无菌培养水（每T75培养瓶10 ml）中孵育，于37℃下静置使其贴壁 °直至微血管接种前均置于 C。
3. 第一周的周三上午，在逐渐增加的二氧化碳气流中处死大鼠₂ 诱导嗜睡、姿势丧失及呼吸停止后，进行颈椎脱位。用70%乙醇喷洒头部。用剪刀剪下头部，并在超净工作台内转移至干燥的培养皿中。
4. 从颅骨中取出大脑，去除小脑和视神经，然后将脑组织转移至一个置于冰上预冷并盛有冷解剖缓冲液（HBSS 添加 1% BSA、100 单位/毫升青霉素和 100 微克/毫升链霉素）的培养皿中 µg/ml
5. 将脑组织沿中线切开，分离两侧大脑半球，并分离中脑与前脑。将前脑转移至冰上装有解剖缓冲液的干净培养皿中。
6. 在新的培养皿中加入几个半球，放入冷解剖缓冲液，在体视显微镜下小心去除前脑的脑膜，使用 N° 5 把弯头镊子。然后清洗脑组织内部，去除髓鞘，获得皮质层。这些步骤应控制在 2 小时内完成，以确保组织保存和细胞存活。
7. 将3个大脑的皮层组织在7 mL的Dounce匀浆器中用6 mL冷解剖缓冲液进行解离，分别使用两种不同间隙的研杵各上下研磨10次，71 µm，随后为20 µm
8. 将悬液分装，每1 mL含相当于1个皮层组织的量，置于50 mL Falcon管中，在1,000 x g 室温下离心5分钟。弃去上清液。
9. 用1 mL含有胶原酶/分散酶混合物（60）的酶溶液消化来自1个皮层的悬液 µg/mL–0.3 U/mL)，DNase I型（35 µg/mL–20 K 单位/mL）和庆大霉素（50 µg/mL）在37℃下振荡30分钟 °C.
10. 将1个皮层的1 mL消化液与10 mL 25% BSA/HBSS 1X混合，通过密度梯度离心法在3,600 x g条件下分离 g 室温下孵育15分钟。小心地将上层圆盘（髓鞘和脑实质）及上清液转移至一个干净的50 mL Falcon离心管中，重复离心。将含有脑微血管的沉淀物保留于4 ℃ °C.
11. 小心弃去上层碟片和上清液。用1 mL冰冷的HBSS 1X重悬含有脑微血管的两个沉淀物，并转移至一支洁净的50 mL Falcon管中。
12. 加入 20 mL 冷的 HBSS 1X 清洗微血管，并在 1,000 x g 5 分钟。弃去上清液。
13. 此外，用1 mL与上述相同的酶溶液消化1个皮质组织中的微血管。 步骤 1.9 37℃下持续1小时 °在摇床中于 C 条件下培养。
14. 然后，将来自3个皮层的消化后微血管混合至一个离心管中，再分装至两个50 mL Falcon离心管，使每管含有相当于1.5个皮层的微血管。每管加入30 mL冷解剖缓冲液，于1,000 x g离心 g 室温下孵育5分钟。
15. 将微血管沉淀物重悬于10 mL DMEM/F12培养基中，该培养基添加有20%牛血小板贫浆来源血清、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，2 ng/mL）和肝素（100 µg/mL)，庆大霉素（50 µg/mL）和 HEPES（2.5 mM），称为内皮细胞培养基（ECM），并添加 4 μg/mL 嘌呤霉素 µg/mL
16. 从培养箱中取出2个已包被的T75培养瓶，吸除多余的包被液，将每根试管中的微血管分别接种至一个T75培养瓶中（每个T75培养瓶接种1.5个皮层提取的微血管）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清	Invitrogen	10270-098	-20 °C / 1年
BSA 第V组分，低内毒素	PAA	K45-011-500g	4 °C
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122	-20 °C
T75 培养瓶	Becton Dickinson Falcon	353135
HEPES 缓冲液 (1 M)	Invitrogen	15630-056	4 °C / 1年
小鼠 IV 型胶原酶 (10 × 1 mg)	Becton Dickinson	356233	-20 °C / 1个月
人血浆纤连蛋白 (5 mg)	Becton Dickinson	356008	-20 °C / 1个月
万纳斯弹簧剪，直头 (9 cm)	Fine Science Tools	91500-09
剪刀，直头 (9 cm)	Fine Science Tools	14568-09
杜蒙特镊子 #5/45 (11 cm)	Fine Science Tools	11251-35
格拉夫镊子，尖端宽度 0.8 mm	Fine Science Tools	11050-10
格拉夫镊子，弯头尖端宽度 0.8 mm	Fine Science Tools	11051-10
胶原酶/分散酶混合物 (2 × 5 mg)	Roche Diagnostics	05 401 054 001	-20 °C / 3个月
DNase I (100 mg / 569 KU / mg)	Sigma Aldrich	DN25-100 mg	-20 °C / 1年
庆大霉素 (10 mg/ml)	Invitrogen	15710-049	4 °C / 1年
DMEM/F12	Invitrogen	31331-028	4 °C
血小板贫浆牛血清 (500 ml)	Clinisciences	BT-214-100	-20 °C / 1年
bFGF (10 µg)	Invitrogen	13256-029	-20 °C / 6个月
猪黏膜肝素钠盐 I 级	Sigma Aldrich	H3149-100KU	4 °C / 1年
嘌呤霉素	Sigma Aldrich	P8833-10 mg	-20 °C / 6个月