血脑肿瘤屏障（BBTB）模型：用于评估治疗药物向肿瘤递送的血脑屏障（BBB）模型改良方法

摘要

来源：Le Joncour, V. 等. 利用体外血-脑肿瘤屏障预测体内载荷递送. J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们描述了一种建立体外模型的全面方案，该模型可模拟血-脑肿瘤屏障。该模型有望用于研究治疗脑肿瘤药物的递送机制。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 建立血脑肿瘤屏障模型

注意：细胞培养基和添加剂详见材料表。

1. 星形胶质细胞的制备
   注意：以下体积适用于10 cm培养皿或T75细胞培养瓶。
   1. 在无菌细胞培养罩内，用5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）小心清洗培养的星形胶质细胞。使用真空泵轻轻弃去PBS，加入2 mL细胞解离试剂，孵育5分钟（37 °C，参见材料表），以使细胞脱离。在显微镜下观察细胞脱离情况。孵育时间不得超过5分钟，以减少对细胞的应激。
   2. 向容器中加入10 mL无菌完全星形胶质细胞培养基（ABM+），以抑制细胞解离试剂的活性。使用无菌移液管将脱离的细胞从容器转移至无菌15 mL离心管中。将细胞悬液在室温（RT）下以250 rcf离心3分钟（加速度：9 rcf/s，减速度：5 rcf/s）。
   3. 同时，准备插入式培养小室（参见材料表）：使用无菌镊子将插入式培养小室的脑侧朝上（图1A）放置于无菌6孔板的盖子上（图1B）。预先确认在操作过程中，将6孔板倒置放置于插入式培养小室上时，不会触碰或移动插入式培养小室。
      注意：正确放置插入式培养小室可使星形胶质细胞悬液被限制在膜与孔底之间。
   4. 离心完成后，小心弃去细胞悬液中的上清液；用1 mL ABM+轻轻在管壁上重悬细胞沉淀，反复吹打最多5次。避免过度移液，以减少对细胞的应激。计数细胞，并将细胞悬液密度调整为每400 µL ABM+中含1.5 × 10⁵个细胞/插入式培养小室。
   5. 将细胞悬液加至插入式培养小室膜的脑侧中央（图1B），并使用无菌移液器吸头通过毛细作用力非常小心地将其铺展。避免直接接触，因为膜特别脆弱。
   6. 保持插入式培养小室的脑侧朝上，将6孔板重新放回插入式培养小室上。这可确保细胞悬液被限制在膜与孔的实际底部之间（图1C）。避免细胞悬液中产生气泡，否则将影响星形胶质细胞在膜上的均匀分布。
   7. 将6孔板与插入式培养小室（脑侧朝上）放入培养箱（37 °C，5% CO₂）中，使细胞贴壁至少2小时（小鼠永生化星形胶质细胞）至最多6小时（人原代星形胶质细胞）。
      注意：由于插入式培养小室处于倒置状态，无法在显微镜下观察细胞贴壁情况。因此，建议另设一个常规细胞培养容器，随时间观察该容器中的细胞贴壁情况。必须小心操作膜，若膜受损，实验结果将不可靠。
   8. 孵育结束后，检查接种区域外是否有细胞悬液泄漏，如有泄漏则弃用该插入式培养小室。将6孔板恢复至正常位置，此时插入式培养小室的血侧朝上（图1A）。向每个孔中加入2.6 mL ABM+。向每个插入式培养小室中加入2.5 mL完全星形胶质细胞培养基，并将板放入培养箱（37 °C，5% CO₂）中。

2. 内皮细胞的制备

注意：对于小鼠脑微血管内皮细胞（bEND3），细胞必须达到100%汇合，以确保在实验当天细胞间接触最大化，从而诱导紧密连接蛋白的最优表达。该要求不适用于人脐静脉内皮细胞（HuAR2T），因为这些细胞的紧密连接蛋白表达需要星形胶质细胞的存在。

1. 按照先前所述星形胶质细胞的细胞解离步骤进行操作。离心后，小心弃去上清液；通过沿管壁缓慢吹打5次，将内皮细胞沉淀重悬于1 mL完全内皮细胞培养基（EBM+）中。避免过度吹打细胞，以减少对细胞的机械刺激。计数细胞，并将细胞悬液密度调整为每2.5 mL插入式培养插件中含2 × 10⁵个细胞，所用培养基为无血清内皮细胞培养基（EBM-）且不含血管内皮生长因子A（VEGF-A）。
2. 取出含有插入式培养插件的培养板，小心弃去血液侧的培养基，替换为2.5 mL内皮细胞悬液。将培养板放回培养箱（37 °C，含5% CO₂），静置过夜，使内皮细胞充分贴附于膜表面。
3. 次日，将预热的无血清星形胶质细胞培养基（ABM-）3 mL转移至无菌6孔板的每个孔中。使用无菌镊子小心操作插入式插件，弃去血液侧的完全内皮细胞培养基，将插件转移至含有ABM-的新培养板中，并在插件内加入2.5 mL EBM-。
   注意：使用EBM-对于建立内皮屏障至关重要。
4. 将插件置于培养箱（37 °C，含5% CO₂）中培养5天，期间尽量减少物理扰动和温度波动，以促进内皮基底膜的形成、星形胶质细胞与内皮细胞的接触，并最终形成血-脑肿瘤屏障（BBTB）模拟结构。在转移胶质瘤细胞培养物当天更换培养基。

3. 胶质瘤细胞的制备

注意：尽管此处使用的是患者来源的胶质母细胞瘤球体，但以下方案可轻松调整用于贴壁生长的商业化胶质母细胞瘤细胞，例如 U-87MG。

1. 如需进行免疫荧光成像，可在含2 mL聚-D-赖氨酸（0.01%）的6孔板中，每孔放置最多4个圆形无菌硼硅酸盐盖玻片（ø 0.9 cm），室温孵育30分钟。
2. 同时，使用无菌移液管小心地将肿瘤球从细胞培养容器转移至15 mL无菌离心管中，以250 rcf离心3分钟。
3. 弃去上清液，轻轻将肿瘤球重悬于1 mL不含bFGF/EGF（GBM-）的胶质瘤细胞培养基中，并计数细胞。用GBM-培养基将细胞密度调整至约10⁴ 个球/mL（10⁵ 个细胞/mL）。
4. 弃去各孔中的聚-D-赖氨酸，用无菌PBS洗涤3次。每孔加入3 mL肿瘤球悬液接种细胞，并将带有血脑屏障模拟结构的插入式培养小室转移至肿瘤细胞悬液上方。
5. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜，使实验体系中血液侧与脑肿瘤侧达到平衡。次日，将血液侧培养基更换为添加了目标分子/药物/纳米颗粒的EBM-培养基。按前一节所述方法，在不同时间点收集样品进行直接定量分析，并在特定时间点固定细胞用于荧光成像。

结果

图1：血-脑肿瘤屏障（BBTB）模型的描述。 (A不同细胞类型位置的示意图。B) 示意图展示将插入式培养小室置于6孔板盖上的位置，以及在插入式培养小室的脑组织侧接种星形胶质细胞的技术’膜。C) 星形胶质细胞黏附用6孔板放置示意图。D) 紧密连接蛋白ZO-1（Zonula occludens-1，上排，红色）和claudin-5（下排，绿色）的免疫荧光显微图像。蛋白表达情况比较了单独培养于BBTB血液侧的鼠脑微血管内皮细胞（bEND3）单层培养（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞
bEND3	 ATCC	 CRL-2299	培养条件：DMEM（1 g/L 葡萄糖）添加 10% FBS、5 mL L-谷氨酰胺和 5 mL 青霉素/链霉素
HIFko 永生化小鼠星形胶质细胞	 由 Gabriele Bergers 博士实验室分离	 https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	培养条件：BME-1 添加 5% FBS、5 mL 1 M HEPES、5 mL 100 mM 丙酮酸钠、3 g D-葡萄糖和 5 mL 青霉素/链霉素
HuAR2T	 由 Dagmar Wirth 博士实验室分离	 https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	 培养条件：EBM-2 加补充剂混合物（正常人原代星形胶质细胞，Lonza CC-2565）；或 ABM 加 SingleQuots
材料与试剂
100 mm × 17 mm Nunclon Delta 培养皿	 ThermoFisher Scientific	 150350
10 mL 血清移液管	 ThermoFisher Scientific	 170361
15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	 ThermoFisher Scientific	 339650
ABM 基础培养基 500 mL	 Lonza	 CC-3187	用于人原代星形胶质细胞。ABM+：包含补充剂混合物中的所有添加剂；ABM-：除 rhEGF 和 FBS 外的所有添加剂
Accutase 细胞解离溶液	 Corning	 25-058-CI
AGM SingleQuots 补充剂与生长因子	 Lonza	 CC-4123
B27 补充剂	 Gibco	 17504-044	适用于 GBM+ 和 GBM- 培养基
基础培养基伊格尔（Basal Medium Eagle）	 ThermoFisher Scientific	 21010046	BME-1
Corning Costar 组织培养处理 6 孔板	 Sigma-Aldrich	 CLS3506
Corning Transwell 聚酯膜细胞培养小室	 Sigma-Aldrich	 CLS3452
D-葡萄糖	 Sigma-Aldrich	 G8270	溶于 50 mL BME-1 中，过滤除菌后加入培养基
杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F-12 营养混合物（Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham）	 Gibco	 21331-020	专用于本实验室分离的患者来源类球体培养； 其他胶质瘤细胞系可能不同
EBM-2 生长培养基补充剂混合物	 PromoCell	 c-39216	EBM+：包含补充剂混合物中的所有添加剂；EBM-：除 VEGF-A 和 FBS 外的所有添加剂
内皮基础培养基 2（EBM-2）	 PromoCell	 c-22211	EBM+：包含补充剂混合物中的所有添加剂；EBM-：除 VEGF-A 和 FBS 外的所有添加剂
胎牛血清（FBS），经认证、热灭活、符合欧盟标准、南美来源	 ThermoFisher Scientific	 10500056
荧光素钠盐	 Sigma-Aldrich	 F6377
Greiner CELLSTAR 96 孔板	 Sigma-Aldrich	 Greiner 655090	黑色聚苯乙烯孔，平底（带 micro-clear 底）
Menzel-Gläser 0.9 cm 圆形硼硅酸盐盖玻片	 Thermo Scientific	 10313573
PBS 片剂	 Medicago	 09-9400-100	每升去离子水使用一片；然后通过高压灭菌对溶液进行灭菌
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	 Sigma-Aldrich	 P6407
重组人 EGF	 Peprotech	 GMP100-15	用于 GBM+ 培养基 
重组人碱性 FGF（154 个氨基酸）	 Peprotech	 100-18B	用于 GBM+ 培养基