从斑马鱼幼鱼中分离脑细胞：一种获取完整神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的技术

摘要

来源：Mazzolini, J. 等. 自幼年斑马鱼脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞并进行RNA提取。 J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了一种通过机械破碎脑组织从幼年斑马鱼脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的实验方案。分离得到的纯化细胞群体可进一步用于基因组学分析。

方案

所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 匀浆化

注意： 所有步骤均在 4 °C 下进行。

1. 在含有50条幼鱼的90 mm培养皿中加入1.5 mL Tricaine（15 mM），该培养皿中已加入50 mL经200 µM PTU处理的E3胚胎培养基，以实现终末麻醉。
   1. 使用3 mL一次性塑料巴斯德吸管从培养皿中吸取10条已麻醉的幼鱼。
   2. 将麻醉后的幼鱼以每批10条的方式转移至盛有冰冻E3胚胎培养基+Tricaine的55 mm培养皿中。
   3. 在体视显微镜下，将10条幼鱼排列于培养皿中央，然后使用手术显微剪在卵黄囊上方横切幼鱼头部（需排除 swim bladder，以避免头部漂浮）。
   4. 使用3 mL一次性塑料巴斯德吸管吸取培养皿中的头部。等待所有头部聚集于吸管尖端后，将其转移至含有1 mL冰冻Media A的玻璃匀浆器中（转移时体积应尽量小，以减少E3+Tricaine对Media A的稀释）。将玻璃匀浆器置于冰上。每种实验条件使用一个独立的匀浆器。
   5. 每隔30分钟更换一次盛有冰冻E3+Tricaine的小型培养皿，以确保横切操作始终在低温E3+Tricaine培养基中进行。
   6. 当玻璃匀浆器中的Media A颜色开始变淡时，更换为新的冰冻Media A。
      注意： Media A被稀释可能导致因温度变化而影响头部组织。
   7. 当所有头部收集完毕（每种条件600个头部）后，尽可能吸除玻璃匀浆器中的Media A，并替换为1 mL新鲜的冰冻Media A。
   8. 在冰上使用紧密贴合的玻璃匀浆器破碎脑组织。对于3–5 dpf的幼鱼进行40次碾磨和旋转操作，对于7和8 dpf的幼鱼进行50次。
2. 向细胞悬液（1 mL Media A/200个头部）中加入2 mL Media A，以稀释细胞并减少其与髓鞘的聚集，从而有利于在密度梯度介质中离心分离。
   1. 为消除细胞聚集，将细胞悬液通过置于冰上预冷的50 mL离心管顶部的40 µm细胞筛网过滤，重复此操作3次。
   2. 将1 mL细胞悬液转移至预冷的1.5 mL离心管中，在4 °C下以300 g离心10分钟。
   3. 使用10 mL注射器+23G×1''针头吸除上清液。
3. 将细胞沉淀用1 mL冰冻的22%密度梯度介质重悬，并在其上方轻柔地覆盖0.5 mL冰冻的DPBS 1x（不要混合，两种溶液之间将形成明显的界面）。
   1. 在4 °C下以950 g离心30分钟，不启用刹车，加速度设为缓慢。
      注意： 此步骤通过将髓鞘隔离在DPBS 1x与22%密度梯度介质的界面处，而细胞则沉淀至管底，从而实现髓鞘与其他细胞的分离。当细胞浓度不过高时，髓鞘去除效率更高。
   2. 使用10 mL注射器+23G×1''针头 尽可能弃除DPBS、密度梯度介质以及滞留在界面处的髓鞘。
   3. 用0.5 mL Media A + 2%正常山羊血清（NGS）洗涤细胞，然后在4 °C下以300 g离心10分钟。
   4. 尽可能弃除上清液，然后将同一实验条件下所有管中的细胞沉淀合并至1 mL Media A + 2% NGS中。
4. 若目标细胞表达荧光蛋白（例如来自mpeg1:eGFP转基因鱼的巨噬细胞/小胶质细胞，或来自NBT:DsRed转基因鱼的神经元），则将细胞悬液通过带有35 µm滤网帽的细胞筛网，并转移至置于冰上、避光保存的5 mL FACS管中。
   注意： 也可选择对小胶质细胞进行免疫染色。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-苯基-2-硫脲（PTU）	Sigma	P7629
Hepes	Gibco	15630-056
D-葡萄糖	Sigma	G8644-100ML
HBSS 1X	Gibco	14170-088
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02
HBSS 10X	Gibco	14180-046
DPBS 1X	Gibco	14190-094
三卡因（MS222）	Sigma	A5040
Sterilin 标准 90 mm 培养皿	ThermoFisher	101VIRR
外科显微剪刀	Fine Science Tools	15000-00
3 mL 巴斯德塑料批量移液管	SLS	PIP4206
玻璃匀浆器	Wheaton	357538
Sterilin 标准 55 mm 培养皿	ThermoFisher	P55V
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02
40 µm 细胞筛	Falcon	352340
50 ml 聚丙烯圆锥形离心管	Falcon	352070
离心机	Eppendorf	5804 R
正常山羊血清（NGS）	Cell Signalling	5425S
35 μm 细胞筛盖	BD	352235