通过免疫染色联合细胞分选法分离小胶质细胞：一种利用荧光激活细胞分选从斑马鱼脑细胞中分离小胶质细胞的免疫染色方法 关键词：小胶质细胞，免疫染色，荧光激活细胞分选，斑马鱼，脑细胞，细胞分离

摘要

来源：Mazzolini, J. 等. 自幼年斑马鱼脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞并提取RNA. J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们通过免疫染色联合细胞分选技术分离斑马鱼的小胶质细胞。分离得到的小胶质细胞可用于后续实验，以研究其在脑部病理过程中的作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会审核。

1. 小胶质细胞免疫染色

注意： 所有步骤均在 4 °C 下进行。

1. 用 0.3 mL 含 2% 正常山羊血清（NGS）的培养基 A 重悬从脑培养细胞中获得的细胞沉淀。将细胞分装至 3 个 1.5 mL 离心管中：一管用于未染色细胞，以检测目标细胞的自发荧光；第二管用于二抗（1/200 稀释）以检测二抗与小胶质细胞的非特异性结合；第三管为实验组（加入 4C4 小鼠单克隆抗体（小胶质细胞特异性）（1/20 稀释）和二抗（1/200 稀释））。
   1. 向所有离心管中的细胞加入 1% 低内毒素无叠氮化物（LEAF）试剂，以阻断 CD16/CD32 与免疫球蛋白 Fc 区域的相互作用。轻轻振荡混匀，每 5 分钟轻摇一次，共孵育 10 分钟。
   2. 向第 3 管细胞中加入 4C4 抗体（1/20 稀释），轻轻振荡混匀，每 10 分钟轻摇一次，共孵育 30 分钟。
   3. 在 4 °C 条件下以 300 g 离心 10 分钟，弃上清液。
   4. 用 0.5 mL 含 2% NGS 的培养基 A 洗涤一次，然后在 4 °C 条件下以 300 ×g 离心 10 分钟。
   5. 用 0.5 mL 含 2% NGS 的培养基 A 重悬细胞沉淀，并加入 1% LEAF，每 5 分钟轻摇一次，共孵育 10 分钟。
   6. 向第 2 和第 3 管细胞中加入二抗（1/200 稀释），避光孵育 30 分钟，每 10 分钟轻摇一次。
   7. 在 4 °C 条件下以 300 g 离心 10 分钟，弃上清液。
   8. 用 0.5 mL 含 2% NGS 的培养基 A 洗涤两次，然后用 1 mL 含 2% NGS 的培养基 A 重悬细胞沉淀。
2. 将细胞悬液通过 35 µm 滤膜帽过滤，并转移至预冷的 5 mL 荧光激活细胞分选（FACS）管中，置于冰上并避光保存。

2. 细胞分选（FACS）

注意： 所有步骤均在 4 °C 下进行。

1. 使用流式细胞分选仪（FACS）对神经元、巨噬细胞/小胶质细胞以及小胶质细胞进行分选。
   注意： 该步骤通常由流式细胞仪平台的技术人员操作，具体设置取决于所使用的仪器类型。
   1. 在每根FACS管中加入终浓度为1 µg/mL的DAPI，用于标记死细胞。
   2. 设置流式细胞仪，从全部脑细胞中分选出神经元、巨噬细胞/小胶质细胞或小胶质细胞。根据细胞大小和颗粒度将细胞与碎片分离，通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）圈选单细胞群体，利用DAPI染色排除死细胞，再根据各自特异性的阳性染色鉴定神经元、巨噬细胞/小胶质细胞或小胶质细胞。
2. 将分选出的细胞收集至预冷的1.5 mL离心管中，每管含1 mL冰上预冷的Media A + 2% NGS。不同细胞类型使用不同的离心管。
   1. 在4 °C条件下，以300 ×g离心10分钟，随后弃去上清液。
   2. 用0.5 mL Media A洗涤一次，尽可能弃去上清液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPES	吉布科	15630-056
D-葡萄糖	西格玛	G8644-100ML
HBSS 1×	吉布科	14170-088
正常山羊血清（NGS）	细胞信号	5425S
35 μm 细胞筛网盖	BD	352235
FACS 管	BD	352063
低内毒素、无叠氮化物（LEAF）	生物传奇	101321
Alexa Fluor 647 山羊抗小鼠 IgG（H+L）	生命科技	A11008
抗 4C4 抗体	由爱丁堡大学 Catherina Becker 提供
FACS 分选仪 FACSAria II	BD	QMRI，FACS 实验室