通过免疫染色偶联细胞分选分离小胶质细胞:一种使用荧光激活细胞分选从斑马鱼脑细胞中分离小胶质细胞的免疫染色方法

Abstract

来源:Mazzolini， J. et al. 从斑马鱼幼虫大脑中分离和提取神经元、巨噬细胞和小胶质细胞。 J. Vis. Exp.（2018 年）

在本视频中，我们通过免疫染色偶联细胞分选分离斑马鱼小胶质细胞。分离的小胶质细胞可用于下游实验，以了解它们在脑病理中的作用。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 小胶质细胞免疫染色

注意:所有步骤均在 4 °C 下进行。

1. 用 0.3 mL 培养基 A + 2% 正常山羊血清或 NGS 重悬从脑培养细胞中获得的细胞沉淀。将它们分成 3 x 1.5 mL 试管:一个用于未染色的细胞，用于测量目标细胞的自发荧光，第二个用于二抗 （1/200），用于测量二抗与小胶质细胞的非特异性结合，第三个作为测试（4C4 小鼠单克隆抗体（小胶质细胞特异性）（1/20） + 二抗 （1/200））。
   1. 向细胞（所有试管）中添加 1% 的无叠氮化物低内毒素 （LEAF），以阻断 CD16/CD32 与免疫球蛋白 Fc 结构域的相互作用。每 5 分钟轻轻搅拌孵育细胞 10 分钟。
   2. 将 4C4 抗体 （1/20） 加入细胞（试管 3）中，每 10 分钟轻轻搅拌孵育 30 分钟。
   3. 在 4 °C 下以 300 g 离心管 10 分钟，然后弃去上清液。
   4. 用 0.5 mL 培养基 A + 2% NGS 洗涤一次，然后在 4 °C 下以 300 x g 离心试管 10 分钟。
   5. 用 0.5 ml 培养基 A + 2% NGS 重悬细胞沉淀，并将细胞与 1% 的 LEAF 孵育 10 分钟，每 5 分钟轻轻搅拌一次。
   6. 将二抗 （1/200） 添加到细胞（试管 2 和 3）中。孵育细胞 30 分钟，每 10 分钟轻轻搅拌一次，并进行光照保护。
   7. 在 4 °C 下以 300 g 离心管 10 分钟，然后弃去上清液。
   8. 用 0.5 mL 培养基 A + 2% NGS 洗涤两次，然后用 1 mL 培养基 A + 2% NGS 重悬细胞沉淀。
2. 通过 35 μm 细胞过滤器盖运行细胞悬液，并将其转移到冰上的 5 mL 荧光激活细胞分选或 FACS 管中，避光。

2. 细胞分选 （FACS）

注意:在 4 °C 下执行所有步骤。

1. 使用 FACS.
   对神经元、巨噬细胞/小胶质细胞和小胶质细胞进行分类 注意:此步骤通常由FACS设施的工作人员执行，设置取决于所使用的设备类型。
   1. 在每个 FACS 管中加入浓度为 1 μg/mL 的 DAPI，以标记死细胞。
   2. 设置 FACS 并从所有脑细胞中分选神经元、巨噬细胞/小胶质细胞或小胶质细胞。根据细胞的大小和粒度将细胞与碎片分离，然后通过前向散射和侧向散射对单个细胞进行门控。通过活细胞中的 DAPI 标记排除死细胞。通过各自的阳性染色识别神经元、巨噬细胞/小胶质细胞或小胶质细胞。
2. 将细胞收集在 1.5 mL 试管中，其中含有 1 mL 冰冷的培养基 A + 2% NGS（冰上）。对每种细胞类型使用不同的试管。
   1. 在 4 °C 下以 300 x g 旋转试管 10 分钟，然后弃去上清液。
   2. 用 0.5 mL 培养基 A 洗涤一次，然后丢弃最大剂量的上清液。

Materials