使用微流控网络与标准灌流室刺激脑切片

摘要

我们演示了一种简单微流控装置的制备方法，该装置可与标准的电生理实验系统集成，以精确控制的方式将脑切片的微尺度表面暴露于不同的神经递质中。

摘要

我们已展示了可轻松与现有电生理装置集成的双层微流控器件的制备方法。该双层微流控器件采用两步标准负性光刻胶光刻工艺制备¹。第一层包含在两端设有进样口和出样口的微通道。第二层包含位于微通道长度方向中点、并与通道宽度中心对齐的微尺度圆形孔。采用被动泵送方法将液体从进样口泵送至出样口²。该微流控器件可与市售灌流室集成，从而实现与电生理系统的无缝连接。从进样口引入的液体流经微通道向出样口移动，同时通过位于微通道顶部的圆形开口进入灌流室的浴液中。因此，置于灌流室浴液中且位于微流控器件上方的脑片底面可暴露于不同的神经递质环境中。由于微流控器件本身具有微米级厚度，且所用材料（玻璃盖玻片和聚二甲基硅氧烷（PDMS））具有良好的透光性，因此可对脑片进行显微成像。该微流控器件能够对引入脑片微环境的化学刺激物进行空间和时间上的精确调控。

方案

SU-8 模具制备

主液配制

1. 采用两步标准负性光刻胶光刻工艺，在硅片基底上制备 SU-8 模具。
2. 使用剃刀去除硅片上的对准标记，因为这些结构（位于硅片外周）的高度超过实际器件结构的高度。
3. 然后用异丙醇清洗硅片，并用 N₂ 气流吹干。在硅片四周使用厚度小于最高器件结构的胶带制成支撑柱，以替代对准标记。
   
   注意：如果支撑柱的高度超过最高器件结构的高度，则在 PDMS 模具中无法形成通孔。
   
   
4. 将模具硅片置于室温的加热板上。

PDMS 溶液的制备

1. 将10份硅弹性体与1份固化剂充分混合，制备4克聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。
   
   注意：确保两种溶液均匀混合，以获得在整个PDMS模具中一致的物理性能。
   
   
2. 使用真空干燥器去除混合过程中PDMS溶液中产生的气泡。

PDMS 涂覆与固化

1. 将无气泡的PDMS溶液缓慢滴加到SU-8模具上，确保在滴加过程中不产生气泡。
2. 将一张可书写透明薄膜的一端放在加热板上，然后缓慢地将其覆盖在PDMS溶液上，以均匀地将PDMS铺展到SU-8模具表面。此过程中产生的任何气泡都需用探针清除。
   
   [注意：切勿抬起透明膜，以免产生更多气泡。]
   
   
3. 在透明薄膜上方放置一块硼硅酸盐玻璃片，以施加均匀压力。轻轻按压最高圆形结构的顶部表面（位于通道长度的中点，并沿通道宽度居中），使透明膜与圆形结构的SU-8表面之间夹带的PDMS最少或没有。
4. 在硅片-硼硅酸盐玻璃片夹层结构上方再放置三块硼硅酸盐玻璃片，以便在固化前和固化过程中对圆形开口结构的顶面持续施加恒定压力。
5. 随后将加热板温度升至75°C，并在此温度下固化PDMS 1小时。之后将加热板降温至50°C。
6. 移去玻璃片，然后小心揭下透明膜，留下表面覆盖有薄层PDMS的模具。

微流控装置的构建

从模具上移除PDMS片

1. 将PDMS片材上的灌注室端口与SU-8母模上的端口对齐后，使用剃刀片在PDMS片材上切出灌注室外缘。
2. 然后轻轻从母模上取下PDMS片材，沿通道长度方向缓慢剥离，以防止PDMS撕裂。将PDMS片材放置在透明胶片上，微流控网络面朝上。
3. 接着使用打孔器制备进样口和出样口。

PDMS 片与玻璃盖玻片的键合

1. 使用3M透明胶带轻轻清洁PDMS片材的键合表面（含有微流控网络的表面）和盖玻片，然后将它们放置在透明薄膜上，最后放入O₂等离子体腔室中。
2. 键合表面以165瓦功率的等离子体处理10秒。立即将经等离子体处理的盖玻片表面与经等离子体处理的PDMS片材表面进行键合。
   
   注意：在盖玻片表面施加轻柔压力，以排除键合表面之间可能滞留的气泡。
   
   
3. 静置5分钟，以确保PDMS与玻璃之间形成良好的键合。5分钟后，轻轻移除用于放置PDMS片材进行键合过程的透明薄膜。
4. 将微流控器件放入氧气等离子体系统中，以使通道具有亲水性。等离子体处理条件为165瓦，持续1分钟。

微流控装置与灌注腔室的整合

灌流室的制备

1. 订购了一个现成的灌注室，并钻出入口和出口端口，以便当微流控装置与灌注室键合时，灌注室和装置上的端口能够对齐。灌注室的底面涂有PDMS，以确保灌注室与微流控装置之间形成紧密密封。
2. 将一张可书写的透明片置于室温下的加热板上。
3. 按照此前所述类似方法制备1克PDMS溶液。将无气泡的PDMS溶液缓慢滴加到透明片上，避免产生气泡。
4. 随后将灌注室放置在PDMS溶液上。
5. 在灌注室上方放置一块硼硅酸盐玻璃片，以施加均匀压力，并在灌注室底面形成一层薄而均匀的PDMS涂层。
6. 然后将加热板温度升至75°C，并在此温度下固化PDMS 1小时。

微流控装置与灌注室的键合

1. 取出平板，轻轻移除透明膜，留下灌注腔室以及底部表面涂有薄层PDMS的结构。使用剃刀片和尖头探针清除通路孔中多余的PDMS。
2. 然后使用3M胶带轻轻清洁微流控装置的PDMS表面以及腔室的PDMS底面，将其放置在透明膜片上，最后放入氧气等离子体腔室中。
3. 表面以165瓦功率的等离子体处理10秒。随后立即将腔室上涂有PDMS的表面与微流控装置的PDMS表面进行键合。
   
   注意：在玻璃表面施加轻柔压力，以排除键合表面间可能夹入的气泡。
   
   
4. 在使用前立即将装置放入氧气等离子体系统中，使通道具有亲水性。等离子体处理条件为165瓦，持续1分钟。

利用微流控装置使脑切片暴露于神经化学微环境

1. 将标准人工脑脊液（Artificial Cerebral Spinal Fluid, ACSF）注入微流控装置与灌流室组合的亲水性微通道中。
2. 在入口端滴加少量 ACSF 溶液，使溶液通过毛细作用进入通道。使用注射器从出口端去除残留气泡。在出口端滴加一大滴 ACSF 溶液，以实现液体从微流控装置的入口端向出口端的被动泵送。
   
   注意： 应小心去除通道中的所有气泡，以确保液体能够通过被动泵送法顺利流动。
   
   
3. 将（微流控装置）-（灌注室）组合体固定在平面上，并将该平面固定到显微镜适配器中。
4. 将标准的进液管和出液管（抽吸管）连接到灌流室，以对脑片持续灌注标准人工脑脊液（ACSF）。使用95% O2-5% CO2混合气体持续饱和ACSF溶液。₂.
   
   注意： 调整吸液管的位置，以维持灌流室浴槽中ACSF液面高度恒定。
   
   
5. 当灌流室充满ACSF溶液后，使用滴管将脑片放入灌流室中。利用探针将脑片定位在微流控装置的圆形孔上方。当脑片处于圆形孔上方的预定位置后，使用脑片固定锚将脑片固定。
6. 现在可以利用流体的被动泵送，通过微流控装置将置于灌注室和微流控网络上方的脑切片暴露于多种神经递质中。

讨论

现有的宏观或微观脑片灌注腔室在提供空间分辨率以向脑片施加神经递质方面存在局限性。本文展示的微流控装置技术利用简单的生物MEMS技术克服了这一限制。由于该微流控装置 fabrication 过程简单，并且易于与现有的电生理系统集成，预计该技术将得到广泛应用。一些此前无法开展的有趣实验，现在可借助当前的微流控装置实现。脑片的不同微环境可在不同时间尺度下暴露于不同的神经递质中。当前的原型装置仅包含四个平行通道以及相邻排列的圆形开口。然而，通过采用不同的设计，可轻松改变该装置的布局，例如采用不同形状或尺寸的开口，或将微通道设计为蜿蜒结构，从而将开口定位在脑片的不同微环境中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RC-26GPL	工具	Warner Instruments	W2-64-0236	低剖面大浴槽 RC-26GLP 记录室
SHD-26GH/10	工具	Warner Instruments	W2-64-0253	用于 RC-26G 的不锈钢切片固定装置，螺纹间距 1.0 mm
PDMS (聚二甲基硅氧烷)	试剂	Dow Corning	Sylgard 184	硅橡胶弹性体套件
Plasma Preen-II 862	工具	Plasmatic Systems, Inc.		微波等离子体系统
Model P-1	工具	Warner Instruments	W2-64-0277	20 系列普通平台，Model P-1
SA-NIK	工具	Warner Instruments	W2-64-0291	尼康 Diaphot/TE200/TE2000 适配器，SA-NIK
含氧并加热的 ACSF（人工脑脊液）	试剂			确切成分根据应用而异