CRISPR-Mediated Base Editing Tools: A Genome Editing Technique to Induce Targeted Base Substitution

doi:10.3791/30303

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

CRISPR 介导的碱基编辑工具:一种诱导靶向碱基替换的基因组编辑技术

July 8, 2025

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Abstract Protocol Disclosures Materials Reprints and Permissions

Abstract

来源:参见 J. E. 等人。使用 CRISPR 介导的碱基编辑器对 BRCA1 变体进行功能评估。J. Vis. Exp.（2021 年）。

该视频解释了 CRISPR 介导的胞嘧啶碱基编辑器用于诱导靶向核苷酸取代的概念。

Protocol

1. 使用 CRISPR 介导的碱基编辑工具创建 BRCA1 变体

注:如果不使用 HAP1-BE3 细胞系，则编码 BE3 的质粒 DNA 可以与靶向 BRCA1 的 gRNA 共转染。与 BE3 和 gRNA 质粒的共转染相比，gRNA 质粒转染 HAP-BE3 细胞可在我们手中的靶基因座上诱导高达 3 倍的高效碱基编辑。

转染前 1 天，将每孔 5 x 10⁵ 个 HAP1-BE3 细胞（或共转染方法中的 HAP1 细胞）接种到 24 孔板中。转染时，培养细胞以达到适当的密度（70%–80% 汇合）。
根据制造商的方案，使用购买的转染试剂（材料表）转染靶向 BRCA1 的 gRNA。使用 1 μg 靶向 BRCA1 的 gRNA（在共转染方法的情况下使用 1 μg 编码 BE3 的质粒 DNA）在 BRCA1 靶位点诱导 C:G 到 T:A 的转化。在 37 °C 下孵育细胞，每 3-4 天传代培养一次。
转染后 3 、 10 和 24 天收获细胞沉淀，以分析碱基编辑效率（转染后 3 天的样品被分析为第 0 天的样品）。
使用基因组 DNA 纯化试剂盒提取基因组 DNA（材料表）.
注:我们建议使用可变试剂与 DNA 的比例来优化转染条件。HAP1 转染的最佳条件是试剂与我们手中的 DNA 的比例为 4:1。

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> Lipofectamine 2000 抗体赛默飞世尔科技 11668027 转染试剂 Opti-MEM 系列吉布科 31985070 转染材料 FuGENE HD 转染试剂普罗梅加编号 E2311 转染试剂 Iscove 改良的 Dulbecco 培养基吉布科 12440046 HAP1 细胞培养基 LentiCas9-Blast Addgene 公司 52962 用于 lentiBE3 克隆的质粒 DNA DNeasy 血液和组织套件 Qiagen（基亚根） 69504 基因组 DNA 制备试剂盒

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video