CRISPR介导的碱基编辑工具：一种诱导靶向碱基替换的基因组编辑技术

摘要

来源：See, J. E., 等. 利用CRISPR介导的碱基编辑器对BRCA1变异体进行功能评估. 视觉化实验杂志 (2021).

本视频讲解了CRISPR介导的胞嘧啶碱基编辑器在实现靶向核苷酸替换中的原理。

方案

1. 利用CRISPR介导的碱基编辑工具创建 BRCA1 变异体

注意：如果未使用 HAP1-BE3 细胞系，可将编码 BE3 的质粒 DNA 与靶向 BRCA1 的 gRNA 共同转染。与共转染 BE3 和 gRNA 质粒相比，在本实验条件下，将 gRNA 质粒转染至 HAP-BE3 细胞可在目标位点诱导出高达 3 倍的高效碱基编辑。

1. 接种 5 × 10⁵ 转染前一天，在24孔板中每孔接种HAP1-BE3细胞（若采用共转染方法，则接种HAP1细胞）。转染时，培养细胞至适宜密度（70%–80%汇合度）。
2. 转染 BRCA1- 使用购买的转染试剂靶向gRNAs（材料表）按照制造商的说明书进行操作。使用1 µg的 BRCA1靶向gRNA（共转染方法中加入1 µg编码BE3的质粒DNA）以诱导C:G向T:A的转换 BRCA1 靶位点。将细胞在37 °C下孵育，并每3–4天传代一次。
3. 转染后第3、10和24天收集细胞沉淀，以分析碱基编辑效率（转染后第3天的样本按第0天样本进行分析）。
4. 使用基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA（材料表).
   注意建议通过调整转染试剂与DNA的比例来优化转染条件。在我们的实验中，HAP1细胞转染的最佳条件为转染试剂与DNA的比例为4:1。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027	转染试剂
Opti-MEM	Gibco	31985070	转染材料
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311	转染试剂
Iscove’s modified Dulbecco’s medium	Gibco	12440046	HAP1 细胞培养基
lentiCas9-Blast	Addgene	52962	用于 lentiBE3 克隆的质粒 DNA
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	基因组 DNA 提取试剂盒