图像引导的机器人细胞微注射：一种用于在脑片器官型培养中向单个神经元细胞精确递送荧光标记多糖的自动化高通量技术

摘要

来源：Shull, G. 等. et al. 利用机器人显微注射技术在脑切片中对单个神经干细胞和神经元进行操作. J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们展示了利用自动注射仪将荧光标记的多糖机器人化地微量注射到小鼠胚胎脑组织切片中的锥体神经元内。该自动注射仪是一种机器人平台，可通过显微镜获取的图像，实现将目标生物分子精确递送至单个细胞内。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 软件安装

1. 按照说明从 https://github.com/bsbrl/Autoinjector 安装软件。

2. 试剂与移液器的准备

1. 琼脂糖：分别取 3 g 宽范围琼脂糖和 3 g 低熔点琼脂糖，各自溶于 100 mL 细胞培养级 PBS 中，使用两个独立的 200 mL 玻璃瓶分别配制。室温保存，最长可保存 3 个月。
2. 台氏液：将 1 g 碳酸氢钠和台氏盐（使用整瓶内容物）以及 13 mL 1 M HEPES 溶解于 1 L 蒸馏水中。调节 pH 至 7.4。使用 0.2 µm 瓶顶滤器过滤溶液。
3. 切片培养基（SCM）：将 10 mL 大鼠血清、1 mL 2 mM 谷氨酰胺、1 mL 青霉素-链霉素（100 倍浓度）、1 mL N-2 补充剂（100 倍浓度）、2 mL B27 补充剂（50 倍浓度）和 1 mL HEPES 缓冲液（pH 7.3）加入 84 mL Neurobasal 培养基中。将 SCM 每 5 mL 分装至 15 mL 离心管中。于 -20 °C 保存。
4. CO₂-非依赖性显微注射培养基（CIMM）：将 DMEM 低糖改型粉末（不含酚红）溶于 200 mL 蒸馏水中，配制成 5 倍浓度溶液。使用 0.2 µm 瓶顶滤器过滤溶液（DMEM 粉末使用整瓶内容物）。配制 100 mL CIMM 时，混合 20 mL 5 倍浓度 DMEM 改型溶液、1 mL HEPES 缓冲液、1 mL N2 补充剂（100 倍浓度）、2 mL B27 补充剂（50 倍浓度）、1 mL 青霉素-链霉素（100 倍浓度）、1 mL 2 mM 谷氨酰胺和 74 mL 蒸馏水。溶液于 4 °C 保存。
5. 重悬缓冲液：将 262 mM NaHCO₃、0.05 N NaOH 和 200 mM HEPES 溶解于蒸馏水中，配制重悬缓冲液。使用 0.22 µm 瓶顶滤器系统过滤除菌，收集至无菌玻璃瓶中。将重悬缓冲液每 500 µL 分装至密封的微量离心管中。于 4 °C 保存。
6. 显微注射染料储备液：将荧光标记的葡聚糖溶于无 RNase 的蒸馏水中（终浓度为 10 µg/µL）。每 5 µL 分装，于 -20 °C 保存备用。
7. 使用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.2 mm，内径 0.94 mm）拉制显微注射移液管。避免移液管接触灰尘。移液管储存时间不得超过 2–3 天。本实验中使用的拉制参数为：HEAT：梯度温度 +1 – 5；PULL：100；VEL：110；DEL：100。其中 HEAT 和 VEL 是对移液管形状和尺寸影响最大的参数。
   注意： 理想的显微注射移液管应具有细长且柔韧的尖端，以避免显微注射过程中对细胞造成损伤。

3. 组织切片制备

1. 在进行脑组织解剖前，使用微波炉熔化3%宽范围琼脂糖。在包埋前，将琼脂糖置于37 °C水浴中以防止其凝固。确保移液器免受灰尘污染。移液器存放时间不得超过2–3天。
2. 解冻一份SCM，并使用水浴将10–12 mL CIMM和20 mL Tyrode’s溶液加热至37 °C。
3. 将荧光示踪剂（Dextran-3000或Dextran-10000-Alexa偶联物；终浓度5–10 μg/μL）与待注射的其他化学物质混合。将显微注射溶液在4 °C下以16,000 x g离心30分钟。收集上清液并转移至新管中。使用前将显微注射溶液置于冰上保存。
4. 使用E13.5–E16.5小鼠胚胎的头部制备端脑的器官型组织切片。用镊子沿中线方向去除皮肤并打开颅骨。从打开的颅骨中分离出胚胎脑组织，并从脑腹侧开始去除覆盖在脑组织上的脑膜。将解剖得到的完整脑组织置于37 °C加热板上的Tyrode’s溶液中。
   注意：3.4中描述的所有解剖步骤必须在预热的Tyrode’s溶液中进行。
5. 将熔化的宽范围琼脂糖倒入一次性包埋模具中。当琼脂糖冷却至38–39 °C时，使用巴斯德移液器小心地将脑组织（最多4个）转移至其中。此步骤始终使用剪口吸头。
6. 使用刮刀或Dumont #1镊子轻轻搅动组织周围的琼脂糖，避免接触组织本身。让琼脂糖在室温下凝固。琼脂糖凝固后，修剪掉组织周围多余的琼脂糖。
7. 在缓冲液托盘中加入PBS。将脑组织的方向调整为头尾轴垂直于托盘（以嗅球作为标志，代表脑的最前端）。使用振动切片机切割250 µm厚的切片。
8. 在3.5 cm培养皿中加入2 mL预热的培养基。使用塑料巴斯德移液器将切片（10–15片）转移至该培养皿中。完成后，将含有切片的培养皿移入切片培养孵育箱。使用前，将切片维持在37 °C、含40% O₂ / 5% CO₂ / 55% N₂的湿润环境中。

4. 显微注射

1. 打开计算机、显微镜、显微镜相机、操纵器、压力装置和压力传感器。通过点击从 GitHub 下载的主文件夹中的“launchapp.py”文件来加载应用程序，并在弹出窗口中指定设备设置（安装说明见步骤 1.1）。
2. 在将移液管浸入溶液之前，先施加向外的压力，以防止意外堵塞。为向移液管施加压力，将补偿压力条滑动至 24–45%，然后点击“Set Values”。接着，根据压力传感器显示的读数，调节机械压力阀旋钮至 1–2 PSI（69–138 mbar），以调整至适当的压力。
3. 将脑片转移至一个含有 2 mL 预热 CIMM 的 3.5 cm 培养皿中。将待注射的脑片置于培养皿中央。将培养皿转移至预热（37 °C）的显微注射载物台上。
4. 使用长尖塑料移液器吸取 1.4–1.6 µL 显微注射溶液（来自步骤 3.3），加载至显微注射移液管中。将显微注射移液管插入移液管固定器中。
5. 使用显微镜的最低放大倍数，使脑片清晰对焦，并引导微移液管进入该视野（FOV），使其与脑片目标处于同一焦平面。切换显微镜输出至相机，以便在应用程序中查看视野。
6. 点击界面左上角的放大倍数按钮，启动设备校准。弹出窗口将提示选择放大倍数。选择 10x 放大倍数，或根据实际使用的物镜倍数（例如 4x、10x、20x、40x）进行选择，然后点击“Ok”。软件默认内置物镜倍数为 10x（最常用的物镜放大倍数）。
7. 使用显微镜的微米调节轮重新对焦移液管尖端，并用光标点击移液管尖端。接着，按下步骤 1.1 按钮，并在弹出窗口中点击“OK”。移液管将在 Y 方向上移动。再次点击移液管尖端，然后按下步骤 1.2 按钮。最后，在“Pipette angle”框中输入 45，并点击“Set angle”。
8. 在自动显微注射控制面板中输入所需参数。若对顶端前体细胞进行显微注射，设置注射距离为 20–40 µm，深度为 10–15 µm；若对神经元进行显微注射，设置从基底侧起始的注射距离为 30–40 µm，深度为 10–30 µm，具体数值取决于靶向目标。速度始终设置为 100%，然后点击“Set values”。
   注意： 接近距离是指移液管在移动至下一个注射点前从组织中退出的距离；深度是指显微注射进入组织的深度；间距是指连续注射点之间的直线距离；速度是指移液管移动的速度，单位为 µm/s。
9. 点击“Draw edge”按钮，在弹出窗口中沿所需路径拖动光标，以定义注射轨迹。对前体干细胞进行显微注射时，靶向端脑表面的腹侧区域。将移液管移至轨迹起点，点击移液管尖端，然后点击“Run trajectory”开始显微注射。对每个目标注射平面重复此步骤（通常进行 3–4 个平面，每个平面注射 40–75 次）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
低熔点琼脂糖	Carl Roth	Cat# 6351.2
宽范围琼脂糖	Sigma-Aldrich	Cat# A2790
Best-CA 221 胶水	Best Klebstoffe GmbH & Co.KG	Cat# CA221-10ml
B-27 添加剂	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17504044
蒸馏水
DMEM-F12 培养基，无 CO2 依赖（不含酚红）	Sigma-Aldrich	Cat# D2906
DMEM-F12 培养基，无 CO2 依赖（含酚红）	Sigma-Aldrich	Cat# D8900
HEPES-NaOH，pH 7.2，1 M（HEPES 缓冲液）	Carl Roth	Cat# 9105.3
L-谷氨酰胺，200 mM	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25030024
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	Cat# 81381
N-2 添加剂	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17502048
Neurobasal 培养基	Thermo Fisher Scientific	Cat# 21103049
无核酸酶水	Thermo Fisher Scientific	Cat# AM9937
O2（40%）、CO2（5%）、N2（55%）混合气，50 升
PBS
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15140122
大鼠血清	Charles River Laboratories
碳酸氢钠（NaHCO3）	Merck	Cat# 106323
氢氧化钠（NaOH）	Merck	Cat# 106482
Tyrode’s 盐溶液	Sigma	Cat# T2145-10x1L)
设备
硼硅酸盐玻璃毛细管，外径 1.2 mm × 内径 0.94 mm	Sutter Instruments	Cat# BF-120-94-10
瓶顶过滤器系统，500 mL	Corning	Cat# 430769
计算机 PC
定制压力装置		Custom pressure rig
电子压力调节器	Parker Hannifin	Cat# 990-005101-002
Falcon 管，15 mL	Corning	Cat# 430791
Falcon 管，50 mL	Corning	Cat# 430829
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	Cat# P-97
镊子，Dumont no. 3	Fine Science Tools	Cat# 11231-30
镊子，Dumont no. 5	Fine Science Tools	Cat# 11255-20
镊子，Dumont no. 55	Fine Science Tools	Cat# 11252-20
加热块	Labtech International	Cat # Dri block Digi2
倒置荧光显微镜	Zeiss	Cat# Axiovert 200
光源	Olympus	Cat# Highlight 3100
手动压力调节器	McMaster Carr	Cat# 0-60 PSI 41795K3
微量移液器加载尖端（Microloader Tips）	Eppendorf	Cat# 5242956.003
微控制器	Arduino	Cat# Arduino Due
显微镜相机 Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3
显微镜用电动 XY 位移台
巴斯德移液管，塑料
培养皿，60 × 15 mm	Greiner	Cat# 628102
培养皿，35 × 10 mm	Nunc	Cat# 153066
培养皿，34 × 14 mm，含 Microwell no. 1.5 盖玻片	MatTek	Cat# P35G-1.5-14-C
移液器支架	Warner Instruments	Cat# 64-2354 MP-s12u
移液器及吸头
拉制仪灯丝，3.0 mm 方形盒式灯丝	Sutter Instrument	Cat# FB330B
脑片培养孵育盒	MPI-CBG	Cat# custom made
电磁阀	Cat# LHDA053321H-A
台式离心机	Heraeus	Cat# 5431622
温度计
三轴操作器	Sensapex Inc	Cat# tree-axis uMP
振动切片机	Leica	Cat# VT1000s
全胚胎培养系统孵育箱	Ikemoto Company	Cat# RKI-10-0310
水浴锅
软件与算法
Arduino	Arduino
Fiji	RRID: SCR_002285
Python	Python Software foundation	Python 2.7.12
ZEN		RRID: SCR_013672