亲水相互作用液相色谱：一种利用亲水性微珠分离亲水极性分析物的技术

摘要

来源：Liu, D., 等 采用超高效液相色谱法进行免疫球蛋白G N-糖链分析。 J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了使用亲水相互作用液相色谱分离亲水性极性化合物的原理。该技术有助于纯化多种极性分析物，包括 N-聚糖。

方案

1. 亲水相互作用色谱法及糖链分析

1. 超高效液相色谱（UPLC）仪器的平衡及流动相的配制
   1. 配制流动相，包括溶剂 A：100 mM 甲酸铵（pH = 4.4），溶剂 B：100% 乙腈，溶剂 C：90% 超纯水（10% 甲醇），溶剂 D：50% 甲醇（超纯水）。
   2. 打开控制流动相的软件。
   3. 以 0.2 mL/min 流速用 50% 溶剂 B 和 50% 溶剂 C 平衡 UPLC 仪器 30 分钟，随后以 0.2 mL/min 流速用 25% 溶剂 A 和 75% 溶剂 B 平衡 20 分钟，最后以 0.4 mL/min 流速进行平衡。
2. 将预先用 2-氨基苯甲酰胺（2-AB）标记的 N-糖链溶解于 25 µL 乙腈（100%）与超纯水按 2:1（v/v）比例配制的混合液中。然后在 4 °C 条件下以 134 × g 离心 5 分钟，并将 10 µL 标记后的 N-糖链上样至 UPLC 仪器中。
3. 以 0.4 mL/min 流速，采用乙腈从 75% 线性梯度降低至 62% 的条件在 25 分钟内分离标记的 N-糖链。随后在 60 °C 条件下，使用葡聚糖校准梯度/糖肽柱在 UPLC 上进行分析运行（样品在进样前保持在 4 °C）。
4. 在激发波长 330 nm 和发射波长 420 nm 条件下检测 N-糖链的荧光信号。
5. 根据峰位置和保留时间对糖链峰进行积分。
6. 按下式计算各糖链峰（GP）相对于所有糖链峰（GPs）的相对含量（百分比，%）：GP1：GP1/GPs×100，GP2：GP2/GPs×100，GP3：GP3/GPs×100，依此类推。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-氨基苯甲酰胺，2-AB	Sigma，中国
乙腈	汇海科仪科技有限公司，中国
甲酸铵	北京敏瑞达科技有限公司
葡聚糖校准梯度/糖肽柱	沃茨科技有限公司，中国
Empower 3.0	沃特斯科技有限公司，美国
GlycoProfile 2-AB 标记试剂盒	Sigma，中国
甲醇	汇海科仪科技有限公司，中国
Milli-Q 纯水仪	默克密理博公司，美国	202-2AB
移液枪	斯莫菲尔科学科技有限公司，中国	Advantage A10
超低温冰箱	赛默飞世尔科技有限公司，美国	PB-10
超高效液相色谱仪	沃茨科技有限公司，中国
真空泵	沃茨科技有限公司，中国	4672100，0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl