反相高效液相色谱法：一种用于定量小鼠肝脏中分离的荧光标记及衍生化唾液酸的可靠方法

摘要

来源：Cao, C. 等. 野生型和CMAH基因敲除小鼠肝脏及乳汁样品中唾液酸的测定 J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们演示了通过高效液相色谱法（HPLC）检测唾液酸，包括N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸。检测前先使用合适的荧光标记试剂对样品进行衍生化处理，以利于荧光检测。

方案

1. 唾液酸的荧光衍生化

1. 配制10 mL OPD溶液，其中包含100 mg邻苯二胺和208 mg亚硫酸氢钠，溶于10 mL蒸馏水中  H₂O
2. 向唾液酸样品中加入 20 µL OPD 溶液。剧烈涡旋振荡 30 秒，然后将样品在避光条件下于 80 °C 孵育 4 小时（即 用铝箔包裹微型离心管。
3. 让样品冷却5分钟，加入80 µL蒸馏水  H₂O，然后在14,000 x g 1 分钟。
4. 将80 µL上清液转移至300 µL高回收HPLC小瓶中。衍生化的唾液酸样品可在4–6 °C下保存长达一周。

2. 唾液酸衍生物的高效液相色谱分析

1. 使用连接在线荧光检测器的标准高效液相色谱（HPLC）系统分析样品。
2. 采用标准尺寸为 250 mm 长、4.6 mm 内径的反相 C18 色谱柱进行分析。
3. 通过将 200 mL 储备液与 800 mL 液相色谱-质谱联用级水（LCMS 级水，LCMS 指液相色谱-质谱联用）混合配制溶剂 A。储备液的配制方法如下：
   1. 将 46 g 甲酸加入 800 mL LCMS 级 H₂O 中。
   2. 逐滴加入氢氧化铵溶液（优级纯 p.a.），调节 pH 至 4.5。
   3. 将溶剂转移至量筒中，并用 LCMS 级  H₂O 定容至 1,000 mL。该储备液可在 4–6 °C 下保存最多 3 个月。
4. 溶剂 B 使用 LCMS 级乙腈。
5. 以 1 mL/min 的流速，采用以下梯度洗脱程序分离唾液酸衍生物：
   1. 起始时，将 10% 的溶剂 B 与溶剂 A 混合。
   2. 从 0 min 到 15 min，通过线性梯度将溶剂 B 的比例逐渐增加至 60%。
   3. 从 15 min 到 16 min，通过线性梯度迅速将溶剂 B 的比例从 60% 增加至 90%，以启动 HPLC 色谱柱的清洗。
   4. 为进一步清洗 HPLC 色谱柱，在 16 min 至 18 min 期间保持溶剂 B 比例为 90%，随后在 18 min 至 19 min 期间逐步将溶剂 B 比例降低至 10%。
   5. 在 19 min 至 24 min 期间，将 HPLC 色谱柱重新平衡至起始条件（10% B）。
6. 向 HPLC 系统中进样 50 µL。
7. 使用荧光检测器在激发/发射波长 373/448 nm 下监测洗脱液，衍生化的唾液酸预计保留时间约为 9 min（Neu5Gc-OPD）和 10 min（Neu5Ac-OPD）。
8. 根据 Neu5Ac（A_Neu5Ac）和 Neu5Gc（A_Neu5Gc）的荧光峰面积计算 Neu5Gc 的相对含量（F_Neu5Gc），计算公式如下：
   F_Neu5Gc [%] = 100×A_Neu5Gc/(A_Neu5Ac+A_Neu5Gc)。对于纯合 Cmah 基因敲除小鼠的乳汁和肝脏样品，F_Neu5Gc 应为 0%；而杂合子和野生型小鼠的 F_Neu5Gc 值则因小鼠年龄和组织类型不同而有较大差异（介于 2% 至 >90% 之间），预期误差范围为 ±12%。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
N-乙酰神经氨酸	Sigma	A0812
N-羟乙酰神经氨酸	Sigma	50644	1 mg 分装量已足够
邻苯二胺	Sigma	694975
亚硫酸氢钠	J&K Scientific Ltd	75234
HPLC 分析
高回收率 HPLC 小瓶	Agilent Technologies	#5188-2788
HPLC 系统	Shimadzu	Nexera
HPLC 荧光检测器	Shimadzu	RF-20Axs
HPLC 色谱柱	Phenomenex	Hyperclone ODS	250 x 4.6 mm
LCMS 级 H2O	Merck Millipore	#WX00011
LCMS 级乙腈	Merck Millipore	#100029	Hypergrade
氢氧化铵溶液	Fluka	#44273	Puriss. p.a.