反相高效液相色谱法:一种从小鼠肝脏中分离的荧光标记和衍生化唾液酸定量的稳定方法

Abstract

来源:Cao， C. et al. 野生型和 CMAH 敲除小鼠肝脏和牛奶样品中唾液酸的测定。J. Vis. Exp.（2017 年）

在本视频中，我们演示了使用高效液相色谱 （HPLC） 检测唾液酸、N-乙酰神经氨酸和 N-乙醇神经氨酸，然后用合适的荧光标记试剂进行衍生化，以辅助荧光检测。

Protocol

1. 唾液酸的荧光衍生化

1. 制备 10 mL OPD 溶液，由 100 mg 邻苯二胺和 208 mg 亚硫酸氢钠在 10 mL 蒸馏 H₂O 中组成。
2. 向唾液酸样品中加入 20 μL OPD 溶液。剧烈涡旋 30 秒，并在 80 °C 下在黑暗中孵育样品 4 小时（即用铝箔包裹微管）。
3. 让样品冷却 5 分钟，加入 80 μL 蒸馏的 H₂O，并以 14,000 x g 离心管 1 分钟。
4. 将 80 μL 从上清液转移到 300 μL 高回收率 HPLC 样品瓶中。衍生的唾液酸样品可在 4-6 °C 下储存长达一周。

2. 唾液酸衍生物的 HPLC 分析

1. 使用连接到在线荧光检测器的标准 HPLC 系统分析样品。
2. 使用标准尺寸为 250 mm 长度和 4.6 mm 直径的反相 C18 色谱柱进行分析。
3. 用 800 mL LCMS 级水（LCMS - 液相色谱质谱法）稀释 200 mL 储备液，制备溶剂 A。储备液本身可以按以下方式制备:
   1. 将 46 g 甲酸加入 800 mL LCMS 级 H₂O 中。
   2. 通过滴加氢氧化铵溶液 （puriss. p.a.） 将 pH 调节至 4.5。
   3. 将溶剂转移到量筒中，用 LCMS 级 H₂O 填充至 1,000 mL。该储备溶液可在 4-6 °C 下储存长达 3 个月。
4. 对于溶剂 B，请使用 LCMS 级乙腈。
以
5. 1 mL/min 的流速分离唾液酸衍生物，梯度洗脱如下:
   1. 首先向溶剂 A 中加入 10% 的混合溶剂 B。
   2. 从 0 min 到 15 min，以线性梯度逐渐增加溶剂 B 的比例至 60%。
   3. 从 15 分钟到 16 分钟，以线性梯度将溶剂 B 的比例从 60% 快速增加到 90%。这将开始清洗 HPLC 色谱柱。
   4. 要进一步清洗 HPLC 色谱柱，请在 16 分钟至 18 分钟之间将溶剂 B 的水平保持在 90%，然后在 18 分钟至 19 分钟之间再次逐渐将溶剂 B 的水平降低至 10%。
   5. 在 19 至 24 分钟之间将 HPLC 色谱柱重新平衡至 10% B 的起始条件。
6. 将 50 μL 样品注入 HPLC 系统。
7. 使用 373/448 nm 的荧光检测器激发/发射波长监测洗脱液，预计衍生的唾液酸保留时间约为 9 分钟（对于 Neu5Gc-OPD）和 10 分钟（对于 Neu5Ac-OPD）。
8. 从 Neu5Ac （A_Neu5Ac） 和 Neu5Gc （A_Neu5Gc） 的荧光峰面积计算 Neu5Gc （F_Neu5Gc） 的相对量，如下所示:
   F_Neu5Gc [%] = 100×A_Neu5Gc/（A_Neu5Ac+A_Neu5Gc）.对于来自纯合子 Cmah 敲除小鼠 F_Neu5Gc 的牛奶和肝脏样品，应为 0%，而杂合子和野生型小鼠的 F_Neu5Gc 值可能因小鼠年龄和组织类型（在 2% 和 >90% 之间）而有很大差异，预期误差范围为 ±12%。

Materials