顶空气相色谱法：一种检测斑马鱼胚胎中乙醇浓度的技术

摘要

来源：Lovely, C. B. 等. 利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇含量. J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了使用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇浓度的方法。该方法为挥发性有机化合物的定性和定量分析提供了有效的工具。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会审核。

1. 使用排水法测量胚胎体积

注意：本实验方案中使用受精后24小时（hpf）的胚胎（图1）。用于体积测量的胚胎不用于乙醇分析。

1. 将10个胚胎及胚外体液置于已标记250 μL体积的1.5 mL微量离心管中（图2A）。加水至250 μL刻度线（参见含染色水的样品示例 图2B).
2. 重复步骤 1.1，为已去除绒毛膜的胚胎设置容器。
   1. 为了去除卵膜，将带有卵膜的胚胎置于含有2 mg/mL蛋白酶混合液的胚胎培养基中，于室温（RT）下在100 mm培养皿中孵育10分钟。每隔几分钟轻轻摇动胚胎，以破裂卵膜。
   2. 所有胚胎脱去绒毛膜后，将去绒毛膜的胚胎从蛋白酶混合液/胚胎培养基中取出，放入盛有新鲜胚胎培养基的新100 mm培养皿中清洗胚胎。重复此清洗步骤1次（共清洗2次）。将胚胎转移至另一个洁净的100 mm培养皿中。
3. 使用尽可能细小的枪头，小心地用 P200 微量移液器移除胚胎周围的全部液体，避免损伤胚胎图2C）并使用天平称量水的重量 <精确至0.1 mg。为测定10个胚胎样本的体积，用250 μL减去所移除水的重量/体积（1 mL水 = 1 g水）。为测定单个胚胎的体积，将250 μL与所移除水的重量之差除以10。
   
   

2. 用乙醇处理胚胎

1. 从交配缸中收集胚胎，并置于标准的100 mm培养皿中。每个培养皿中放置的胚胎数量不超过100个，并在28.5 °C条件下孵育。
   注意：如果需要去除卵膜（步骤1.2），则必须在添加乙醇之前完成去除。
2. 在受精后6小时（6 hpf），将最多100个胚胎转移至新的标准100 mm培养皿中，培养皿内含胚胎培养液或含1%乙醇（v/v）的胚胎培养液。盖上皿盖，但切勿密封培养皿。将胚胎置于设定为28.5 °C的低温培养箱中孵育18小时，或直至胚胎发育至24 hpf的发育阶段。

3. 胚胎处理前用于顶空气相色谱分析的准备工作流程

1. 配制5 M NaCl水溶液（每个样品管需要450 μL），以使所有蛋白质变性并防止乙醇代谢。在胚胎培养基中配制蛋白酶混合液，浓度为2 mg/mL。
2. 为每个样品标记一个1.5 mL微量离心管和一个2 mL气相色谱瓶。同时为下述乙醇标准品，以及空气、水、5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样，标记额外的2 mL气相色谱瓶。
3. 准备三支移液器：两支p200移液器调至50 μL，第三支调至200 μL；一支p1000移液器调至450 μL，以及一支p2移液器调至2 μL。用于将胚胎从培养皿转移至1.5 mL微量离心管的玻璃移液管，需快速将管尖通过火焰以使边缘平滑，避免吸取胚胎时造成损伤。

4. 胚胎顶空气相色谱分析的处理

注意：为保持稀释因子计算的一致性，无论胚胎是否仍处于绒毛膜内，均按相同方式处理。

1. 使用两支已设定为 50 μL 的 p200 微量移液器，其中一支吸取 50 μL 蛋白酶混合液，另一支吸取 50 μL 水。
2. 使用玻璃移液管和微量移液器，迅速将 10 个胚胎（来自步骤 2.2）放入一个 1.5 mL 微量离心管中，并盖紧管盖（如图 2A所示）。对所有待测样品、对照组以及乙醇处理的胚胎重复此操作。
3. 使用设定为 200 μL 的 p200 微量移液器，迅速打开管盖并吸除所有残留的胚胎培养液（如图 2C所示）。迅速将装有 50 μL 水的移液器插入管中，快速但轻柔地加入水后再吸出（避免损伤胚胎）。紧接着，迅速加入另一支移液器中预装的 50 μL 蛋白酶混合液，并盖紧管盖（图 2D）。
   注意：此操作应逐个样品进行。
4. 将样品在室温下静置 10 分钟，使蛋白酶混合液充分降解卵膜。随后，迅速加入 450 μL 的 5 M NaCl 溶液，并盖紧管盖（图 2E）。将样品涡旋振荡 10 分钟。为加快处理速度，可设置混合仪同时振荡多个样品。
   注意：对于发育超过 24 hpf 的胚胎样品管，需加入少量（约 100 μL）硅胶珠混合物（两种粒径：0.5 mm 和 1 mm）。在较老的胚胎中，无论匀浆时间多长，脊索仍会保持完整。
5. 匀浆 10 分钟后，迅速取出 2 μL 匀浆后的胚胎上清液，加入气相色谱小瓶中，并立即用聚四氟乙烯盖密封小瓶。

5. 准备培养基和乙醇标准品

1. 制备培养基标准品时，用5 M NaCl/蛋白酶混合液将培养基稀释10倍。取每种样品各2 μL加入气相色谱瓶中，并用聚四氟乙烯盖密封。
2. 制备乙醇标准品时，将100%乙醇用5 M NaCl/蛋白酶混合液进行系列稀释，配制成以下浓度：0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 mM。取每种标准品各2 μL加入气相色谱瓶中，并用聚四氟乙烯盖密封。

6. 顶空气相色谱的准备

注意：顶空气相色谱法用于定量乙醇含量，而非用于分离。

1. 将自动进样器加热器设置为 58 °C 并开启。待加热器温度升至 58 °C 后，打开供给气相色谱仪的空气和氢气气路（用于乙醇定量的火焰离子化检测）。
   注意：应根据制造商的规格要求，将气压（psi）设置为适合色谱仪正常运行的数值。确保氦气气路已打开并调节至正确的 psi 值。
2. 对于进样隔垫，确保已注入的样品数不超过 >100 次；对于进样纤维，确保已注入的样品数不超过 >500 次。
   注意：若任一组件的进样次数超过上述限值，则在运行待测样品前必须予以更换。
3. 启动分析软件，并确保工作站已正确配置。按照实验室/部门标准存储所有数据。为待测样品创建新的样品列表。
4. 启动初始化方法，并在运行样品前等待火焰离子化检测器稳定。检测器稳定后，运行软件中的初始化方法以清洗纤维。

7. 使用顶空气相色谱法进行样品检测

1. 启动方法完成后，在样品列表中为每个样品创建 1 个新行。从分析软件的方法菜单中，为样品列表上的每个样品加载 436 Current spme ethanol 2013 3min absorb 2_5min rg run.METH。
   1. 填写样品列表，首先输入空气、水、5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样品，然后按顺序输入标准品，浓度从 0.3125 mM 到 40 mM。标准品之后，再次输入第二轮空气、水和 5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样品。
   2. 输入所有待测的匀浆胚胎上清液样品，按预测乙醇浓度从低到高排列。最后输入第三轮也是最终一轮的空气、水和 5 M NaCl/蛋白酶混合液空白样品。
2. 按照样品输入的顺序，将气相色谱小瓶加入自动进样器中。让样品预热 10–15 分钟。在软件中启动样品运行。
3. 所有样品及最终空白样品运行结束后，在样品列表中添加最后一个样品并运行 standby.METH，以在软件中启动关机方法。备份样品运行期间获取的所有数据。按以下顺序关闭设备：自动进样器加热器、氢气瓶，待色谱仪温度降至 30 °C 后，再关闭空气瓶。氦气瓶保持开启，以保护石蜡柱。

8. 样品乙醇峰积分与样品浓度分析

注意： 从 8.3 开始的所有数值均在 Excel 文件中计算得出，所有方程已预先填好。

1. 关闭方法完成后，点击“打开色谱图”，打开包含结果的文件夹。该程序会自动对样品进行积分。
2. 在结果中，确认已对正确的峰进行了积分（乙醇峰应在 2 至 2.5 之间）。待所有样品均确认无误后，打印或导出结果。
3. 将乙醇标准品的峰高绘制在图表上。计算乙醇标准品的斜率、Y 轴截距和 R² 值（R² 应 >0.99）。
   注意：这些数值将用于根据样品峰高确定乙醇浓度。
4. 对于每个样品，用样品的峰高减去乙醇标准品的 Y 轴截距，再将所得数值除以乙醇标准品的斜率，得到每个样品在 GC 小瓶中的乙醇值。
   
5. 为计算胚胎中的乙醇浓度，首先计算每个样品的稀释因子。取本实验方案第 1.3 步中计算出的体积值，除以该体积值加上 500 μL。该数值代表在胚胎处理过程中（步骤 4.3 和 4.4）加入每个样品的 5 M NaCl/蛋白酶混合液的体积。
   
6. 利用该样品稀释因子，乘以每个样品的乙醇值，所得结果单位为 mM。通过将培养基中乙醇值乘以 10 的稀释因子，计算培养基参考样品的浓度。
   
   

结果

图1： 胚胎在受精后24小时（hpf）时位于绒毛膜内的图像。胚胎和卵黄被胚外液包围，全部位于绒毛膜内。

图 2： 胚胎体积测量及胚胎处理用于分析的实验方案。(A) 将10个24 hpf胚胎转移至一个已在250 μL刻度处标记的1.5 mL微量离心...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动进样器，CP-8400	Varian		气相色谱自动进样器
乙醇	Decon Labs	2701
带聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料盖的2 mL气相色谱小瓶	Agilent	8010-0198	小瓶清洗后可重复使用，但盖子和隔垫不可重复使用
气相色谱仪，CP-3800	Varian
氦气			由大学合同提供
HP Innowax 毛细管柱	Agilent	19095N-123I	30 m × 0.53 mm × 1.0 μm 膜厚
氢气			由大学合同提供
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	2682002
10 μL 微量移液器吸头	Fisher Scientific	13611106
1000 μL 微量移液器吸头	Fisher Scientific	13611127
200 μL 微量移液器吸头	Fisher Scientific	13611112
Pipetman L p1000L 微量移液器	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L 微量移液器	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L 微量移液器	Gilson	FA10001M
聚四氟乙烯/硅胶隔垫和塑料盖	Agilent	5190-7021	气相色谱小瓶的替换盖/隔垫
固相微萃取纤维组件 Carboxen/聚二甲基硅氧烷	Millipore Sigma	57343-U	替换用纤维
Star 色谱工作站	Varian		色谱分析软件
Thermogreen 低流失（LB-2）隔垫	Millipore Sigma	23154	进样口替换隔垫