蓝非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种用于分析完整线粒体呼吸链复合物的非变性分离技术

摘要

来源：Konovalova, S. 利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析培养的人类细胞中线粒体呼吸链复合物. J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了一种称为蓝色天然PAGE的电泳技术，用于分析线粒体呼吸蛋白复合物在其天然折叠且功能活性状态下的情况。阴离子考马斯亮蓝染料使蛋白复合物带负电荷，从而能够基于其大小和结构进行分离。

方案

1. 缓冲液与溶液的配制

注意：本实验方案中使用的所有缓冲液和溶液均汇总于表1。所列缓冲液体积足以用于制备和运行10个样品。所有缓冲液可在+4 °C下保存长达一年。

1. 配制 20 mL 3 倍凝胶缓冲液，其中包含 1.5 M 氨基己酸和 150 mM Bis-tris，溶于蒸馏水（dH₂O）中。调节 pH 至 7.0。
2. 配制 10 mL 2 M 氨基己酸溶液，溶于蒸馏水（dH₂O）中。
3. 通过混合以下组分配制 1 mL 线粒体缓冲液：0.5 mL 3 倍凝胶缓冲液、0.5 mL 2 M 氨基己酸和 4 µL 500 mM EDTA。
4. 配制 1,000 mL 阴极缓冲液，其中包含 15 mM Bis-tris 和 50 mM 三羟甲基甘氨酸（tricine），溶于蒸馏水（dH₂O）中。调节 pH 至 7.0。
   1. 向 200 mL 阴极缓冲液中加入 0.04 g 考马斯亮蓝 G-250，配制 200 mL 蓝色阴极缓冲液。
5. 配制 1,000 mL 阳极缓冲液，其中包含 50 mM Bis-tris，溶于蒸馏水（dH₂O）中。调节 pH 至 7.0。

结果

表1：BN-PAGE所用的缓冲液和溶液

缓冲液或溶液	组成	配方
3 × 凝胶缓冲液	1.5 M 氨基己酸	3.94 g 氨基己酸
	150 mM Bis-tris	0.63 g Bis-tris
	dH2O	加入 dH₂O20 至 20 mL
	pH 7........

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 细胞培养皿	Thermo Fisher Scientific	130182
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37.5:1	Bio-Rad	161-0148
氨基己酸	Sigma	A2504
过硫酸铵	Sigma	A3678
Bis-tris	Sigma	B7535
Bradford 蛋白检测试剂盒	BioRad	5000006
细胞刮棒	Fisher	11597692
考马斯亮蓝 G250（Serva Blue G）	Serva	35050
皂苷	Sigma	D141
DMEM 培养基	Lonza	12-614F/12
EDTA	Life Technologies	15575-038
FBS	Life Technologies	10270106
胎牛血清	Life Technologies	10270106
甘油	Sigma	G5516
梯度混合器	Bio-Rad	1654120
十二烷基麦芽糖苷（n-Dodecyl β-D-maltoside）	Sigma	D4641
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030024
L-谷氨酰胺	Gibco	25030
N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma	T9281
PBS	Life Technologies	BE17-516F
青霉素/链霉素	Lonza	17-602E
青霉素/链霉素	Gibco	15140
电泳电源	GE Healthcare	EPS 301
蛋白酶抑制剂	Thermo Scientific	10137963
Trans-blot turbo 小型 PVDF 转膜系统	BioRad	1704156
Tricine	Sigma	T9784
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15400054
垂直电泳装置	BioRad	1658004