来源：Konovalova, S. 利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析培养的人类细胞中线粒体呼吸链复合物. J. Vis. Exp. (2019)
在本视频中，我们演示了一种称为蓝色天然PAGE的电泳技术，用于分析线粒体呼吸蛋白复合物在其天然折叠且功能活性状态下的情况。阴离子考马斯亮蓝染料使蛋白复合物带负电荷，从而能够基于其大小和结构进行分离。
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方法文章
蓝非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种用于分析完整线粒体呼吸链复合物的非变性分离技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 缓冲液与溶液的配制
注意：本实验方案中使用的所有缓冲液和溶液均汇总于表1。所列缓冲液体积足以用于制备和运行10个样品。所有缓冲液可在+4 °C下保存长达一年。
- 配制 20 mL 3 倍凝胶缓冲液，其中包含 1.5 M 氨基己酸和 150 mM Bis-tris，溶于蒸馏水（dH2O）中。调节 pH 至 7.0。
- 配制 10 mL 2 M 氨基己酸溶液，溶于蒸馏水（dH2O）中。
- 通过混合以下组分配制 1 mL 线粒体缓冲液：0.5 mL 3 倍凝胶缓冲液、0.5 mL 2 M 氨基己酸和 4 µL 500 mM EDTA。
- 配制 1,000 mL 阴极缓冲液，其中包含 15 mM Bis-tris 和 50 mM 三羟甲基甘氨酸（tricine），溶于蒸馏水（dH2O）中。调节 pH 至 7.0。
- 向 200 mL 阴极缓冲液中加入 0.04 g 考马斯亮蓝 G-250，配制 200 mL 蓝色阴极缓冲液。
- 配制 1,000 mL 阳极缓冲液，其中包含 50 mM Bis-tris，溶于蒸馏水（dH2O）中。调节 pH 至 7.0。
- 配制 2.5 mL 样品缓冲液，其中包含 750 mM 氨基己酸和 5% 考马斯亮蓝 G-250，溶于蒸馏水（dH2O）中。
2. 线粒体裂解物的制备
- 在收集样品的前一天接种细胞。对于 HEK293 或 143B 细胞，使用含 10% 胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 mg/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。将细胞置于 +37 °C、5% CO2 湿度恒定的细胞培养箱中培养。确保在收集当天每份样品至少有 500,000 个细胞。
- 用预冷的 PBS 轻柔洗涤细胞一次，避免细胞从培养皿上脱落。刮下细胞并在 +4 °C 下以 800 × g 离心 10 分钟，收集细胞沉淀。
- 用预冷的 PBS 洗涤细胞沉淀两次，离心条件同 步骤 2.2。使用商用试剂盒通过 Bradford 法测定蛋白浓度。在 +4 °C 下以 800 × g 离心 10 分钟，收集细胞沉淀。
注意： 细胞收集后，所有操作均在 +4 °C 下进行，且不得涡旋震荡。 - 通过向 20 mL PBS 中加入 200 µL 100× 蛋白酶抑制剂，制备含蛋白酶抑制剂的 20 mL PBS 溶液。置于冰上保存。用含蛋白酶抑制剂的 PBS 重悬细胞，使最终蛋白浓度为 5 mg/mL。
- 为计算以 5 mg/mL 浓度重悬细胞所需的含蛋白酶抑制剂 PBS 体积，需先计算每份样品中的蛋白总量。该计算应基于 步骤 2.3 中测得的蛋白浓度以及 步骤 2.3 洗涤后用于重悬细胞的 PBS 体积。
- 制备 1 mL 含蛋白酶抑制剂的 PBS 中 3.3 mM 桔霉素溶液。将 3.3 mM 桔霉素加入体系中，使其终浓度为 1.65 mM。充分混匀后冰上孵育 5 分钟。
- 为制备 1 mL 含蛋白酶抑制剂的 PBS 中 3.3 mM 桔霉素溶液，将 4 mg 桔霉素溶于 1 mL PBS 中，加热至 100 °C 直至无可见沉淀，立即置于冰上冷却。向 1 mL 桔霉素溶液中加入 10 µL 100× 蛋白酶抑制剂。
注意： 必须使用新鲜配制的桔霉素溶液。
注意： 桔霉素具有毒性！操作时需佩戴口罩、手套和实验服。
- 为制备 1 mL 含蛋白酶抑制剂的 PBS 中 3.3 mM 桔霉素溶液，将 4 mg 桔霉素溶于 1 mL PBS 中，加热至 100 °C 直至无可见沉淀，立即置于冰上冷却。向 1 mL 桔霉素溶液中加入 10 µL 100× 蛋白酶抑制剂。
- 向体系中加入含蛋白酶抑制剂的 PBS（在 步骤 2.4 中制备），使终体积为 1.5 mL。在 +4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。此步骤中线粒体被沉淀下来。
- 用线粒体缓冲液重悬线粒体沉淀。线粒体缓冲液的体积为 步骤 2.4 中 PBS 体积的一半。
- 新鲜配制含蛋白酶抑制剂的 PBS（在 步骤 2.4 中制备）中 10% 十二烷基麦芽糖苷溶液。每 10 个样品准备 1 mL 即可。将 10% 十二烷基麦芽糖苷加入体系中，使其终浓度为 1%。冰上孵育 15 分钟（此步骤可延长至数小时）。
- 在 +4 °C 下以 20,000 × g 离心 20 分钟。将上清液转移至新离心管中。使用试剂盒通过 Bradford 法测定蛋白浓度。加入样品缓冲液，其体积为 步骤 2.8 中所用十二烷基麦芽糖苷体积的一半。样品可在 -80 °C 下保存长达 6 个月。
3. BN-PAGE 用梯度凝胶的制备
- 在室温下配制用于BN-PAGE的梯度凝胶。将梯度混合器置于搅拌台上，并通过软管连接至蠕动泵。将带有针头的输液装置连接至软管。将磁力搅拌子放入梯度混合器的近端室中。用去离子水冲洗软管2O，在最大泵速下运行10分钟。
- 排空管道和梯度混合器。使用移液器移除残留的 dH₂O。2关闭梯度生成器各室之间通道及管路的阀门。
- 使用铸模架和夹子将两块玻璃板组装在底部带孔的支架中，并将支架放置在支架台上。确保其大致处于水平位置，可借助水平仪调整。将连接 tubing 的针头置于两块玻璃板之间。
- 制备6%和15%的凝胶溶液（表2）。保持在冰上。最后加入过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）（二者可引发聚合）。轻轻混匀，避免产生气泡。
- 在梯度凝胶混合器管腔的近端加入6%凝胶，远端加入15%凝胶。凝胶总体积应等于玻璃板之间分离胶的体积。因此，制备一块8.3 cm × 7.3 cm的凝胶时，需向梯度凝胶混合器中加入2.6 mL的6%凝胶和2.1 mL的15%凝胶。
- 打开磁力搅拌器，开启梯度混合器各室之间的管路和通道。立即启动蠕动泵，流速调至5 mL/min。用凝胶填充玻璃板，注意避免气泡进入凝胶。当管路中无凝胶时，移除针头。
- 轻轻将凝胶覆盖上 dH₂O2O. 将凝胶在室温下放置至少1小时以完成聚合。
- 灌胶后立即用去离子水充满梯度室，冲洗导管2O，并以最大速度使用蠕动泵。当制备两块或多块凝胶时，每次制备之间务必清洗系统。
- 通过将3 mL的3x凝胶缓冲液与6 mL的dH₂O混合，配制1x凝胶缓冲液2O. 移除 dH₂O2用滤纸轻轻吸去凝胶表面的液体。用1×凝胶缓冲液清洗凝胶表面。再用滤纸轻轻吸去1×凝胶缓冲液。
- 避免滤纸纤维落入凝胶中。为确保这一点，需用剪刀将滤纸剪成小片，切勿撕裂滤纸。
- 将梳子置于两块玻璃板之间，但不要完全浸入，以便能在梳子下方倒入浓缩胶。制备4%浓缩胶（表2加入APS和TEMED作为最后一步，因为它们容易引发聚合反应。轻轻混匀，避免产生气泡。
- 覆盖浓缩胶，避免梳子下方产生气泡，并将梳子完全浸入其中。让浓缩胶聚合至少30分钟。取出梳子，并用1×凝胶缓冲液通过移液器冲洗加样孔。
- 凝胶聚合后可在 +4 °C 保存数天。保存时，用浸有去离子水的滤纸包裹凝胶2O 和塑料膜以防止凝胶干燥。
4. 蓝色天然凝胶电泳
注意：为防止氧化磷酸化复合物降解，请在 +4 °C 下进行电泳，并使用预冷的缓冲液。
- 用蓝色阴极缓冲液填充凝胶板，直至加样孔底部。当凝胶板未完全充满时，加样操作更为方便。先用蓝色阴极缓冲液冲洗加样孔，然后用移液器将蓝色阴极缓冲液加入加样孔中。
- 将样品（5–30 µg 蛋白质）加入加样孔中。轻轻将凝胶板顶部用蓝色阴极缓冲液加满，并向电泳槽中加入阳极缓冲液。
- 以40 V恒定电压电泳15分钟，随后将电压升至80 V（或使用6 mA恒定电流），电流不得超过10 mA。持续电泳直至染料迁移至凝胶长度的2/3处。
- 将蓝色阴极缓冲液更换为普通阴极缓冲液，继续电泳直至染料前沿跑出凝胶。总体而言，电泳过程约需3小时。
- 取出玻璃板，通过半干转法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
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结果
表1：BN-PAGE所用的缓冲液和溶液
| 缓冲液或溶液 | 组成 | 配方 |
| 3 × 凝胶缓冲液 | 1.5 M 氨基己酸 | 3.94 g 氨基己酸 |
| 150 mM Bis-tris | 0.63 g Bis-tris | |
| dH2O | 加入 dH₂O20 至 20 mL | |
| pH 7.... |
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm 细胞培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
| 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 氨基己酸 | Sigma | A2504 | |
| 过硫酸铵 | Sigma | A3678 | |
| Bis-tris | Sigma | B7535 | |
| Bradford 蛋白检测试剂盒 | BioRad | 5000006 | |
| 细胞刮棒 | Fisher | 11597692 | |
| 考马斯亮蓝 G250（Serva Blue G） | Serva | 35050 | |
| 皂苷 | Sigma | D141 | |
| DMEM 培养基 | Lonza | 12-614F/12 | |
| EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10270106 | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | |
| 梯度混合器 | Bio-Rad | 1654120 | |
| 十二烷基麦芽糖苷（n-Dodecyl β-D-maltoside） | Sigma | D4641 | |
| L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030024 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | |
| N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED） | Sigma | T9281 | |
| PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
| 青霉素/链霉素 | Lonza | 17-602E | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140 | |
| 电泳电源 | GE Healthcare | EPS 301 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Thermo Scientific | 10137963 | |
| Trans-blot turbo 小型 PVDF 转膜系统 | BioRad | 1704156 | |
| Tricine | Sigma | T9784 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| 垂直电泳装置 | BioRad | 1658004 |
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