管形成实验用于评估肿瘤细胞的血管活性。
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摘要
摘要
在过去的几十年中，通常采用使用生长因子减少型Matrigel的管形成实验来证明血管内皮细胞在体外的血管生成活性in vitro1-5。然而，近年来越来越多的证据表明，该实验并不仅限于检测内皮细胞的血管行为，还被用于检测多种肿瘤细胞形成血管样表型的能力6-8。这种能力与其在异种移植动物模型中观察到的血管生成样行为一致，该过程被称为血管生成拟态（vasculogenic mimicry, VM）9。大量证据表明，肿瘤细胞介导的VM在肿瘤发育过程中发挥着至关重要的作用，且独立于内皮细胞的血管生成过程6, 10-13。例如，在黑色素瘤和胶质母细胞瘤患者的组织样本中发现，肿瘤细胞可参与血液灌注的血管样通道的形成8, 10, 11。在此，我们描述了这种管状网络实验作为评估肿瘤细胞血管生成活性的有效工具。我们发现，某些肿瘤细胞系（如黑色素瘤B16F1细胞、胶质母细胞瘤U87细胞和乳腺癌MDA-MB-435细胞）能够形成血管样管状结构，而另一些细胞（如结肠癌HCT116细胞）则不能。此外，这种血管样表型依赖于接种在Matrigel上的细胞数量。因此，该实验可作为一种强有力的工具，用于筛选包括血管细胞、肿瘤细胞及其他细胞在内的多种细胞类型的血管形成潜能。
方案
1. 一种基于Matrigel的管状结构形成实验，用于评估肿瘤细胞的血管生成活性
- 肿瘤细胞与微血管内皮细胞的制备：将脑肿瘤细胞（如 U87 细胞）、黑色素瘤细胞 B16F1、乳腺癌细胞 MDA-MB-435 以及结肠癌细胞 HCT116 在添加 10% 胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（均来自 Invitrogen）的 DMEM 培养基中培养。人微血管内皮细胞系（HMVECs）则在 EBM2 培养基（Lonza）中培养，该培养基添加了 1 μg/ml 氢化可的松、1 ng/ml 表皮生长因子、10% FBS 及青霉素/链霉素。细胞用 PBS 洗涤三次后，使用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA（Invitrogen）消化脱落。以 2,000 rpm 离心 5 分钟后，再次用 PBS 洗涤细胞沉淀。随后用血细胞计数板对细胞沉淀进行计数。
- Matrigel 准备：取一份生长因子减少型 Matrigel（BD Bioscience），在室温下预温。在尚未完全解冻前转移至冰上，并将液体置于冰上至少保持 10 分钟。然后将 50 μl Matrigel 加入平放的 96 孔板中，使其均匀分布，并在 37°C 下孵育 30 分钟。
- 管状结构形成：将肿瘤细胞或内皮细胞（1–2 × 104）重悬于无血清的 DMEM（肿瘤细胞）或 EBM-2（内皮细胞）培养基中，接种至 Matrigel 表面。若该实验用于检测某些试剂对管状结构发育的影响，则将这些试剂（激动剂或抑制剂）加入无血清培养基中。每个实验条件组包含 4–6 个孔。
- 图像与数据分析：在 37°C 下孵育过夜后，直接在显微镜下分析每孔。若需固定管状结构，可轻柔加入 100 μl 10% 甲醛生理盐水溶液，10 分钟后即可进行分析。在 10× 相差显微镜下拍摄每个视野中的管状结构，并对每孔中 3–5 个随机视野的平均管状结构数量进行计数。
2. 典型结果：
HMVECs 被用作阳性对照，因为这些管状结构由清晰的细长细胞体延伸并相互连接形成多边形网络。B16F1、U87 和 MDA-MB-435 细胞形成的血管样管状结构与 HMVECs 形成的结构相似，但 HCT116 细胞则不能（图 1）。在 U87 细胞中检测了细胞剂量依赖性的管形成能力。如图 2 所示，10,000 个细胞形成了不连续的管状结构。当细胞数量增加一倍后，形成的完整血管网络与 HMVECs 中观察到的结构相当。相比之下，细胞数量少于 5,000 时则无法形成血管表型。
图 1. HMVEC、U87、MDA-MB-435 和 B16F1 细胞诱导形成管状结构，而 HCT116 细胞则不能。 所有细胞（2 × 104）接种于 Matrigel 上，并培养过夜。使用相差显微镜观察管状结构。HMVEC 作为阳性对照。展示的是 3–5 个视野的代表性图像。标尺：100 μm。
图2. U87细胞以细胞数量依赖的方式诱导管状结构形成。 如图角标所示，使用不同数量的U87细胞进行管形成实验。HMVEC细胞作为阳性对照。比例尺：100 mm。
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讨论
为了确保本实验成功，应首先测试 Matrigel 的质量。可从 BD Bioscience 获取少量样品，使用 HMVEC 进行预实验。不同批次的产品可能表现出不同的质量，部分批次无法为管状结构形成提供最佳条件。其次，在将 Matrigel 分装至 96 孔板时应避免产生气泡，因为气泡会干扰管状结构的形成。如果在孔中发现微小气泡，可立即将 Matrigel 移回原始的 Matrigel 管中，实验过程中这些管子应始终保持在冰上。此外，所用细胞应维持在对数生长期的生长速率。当培养条件显示细胞生长缓慢时，应更换为状态良好的细胞。最后，若未对形成的管状结构进行固定，则在显微镜下观察的时间不应超过一小时，因为温度降低（室温）可能影响管状结构的形成。整个实验应在 24 小时内完成，以避免因细胞死亡导致管状结构破坏。众所周知，管状结构的形成涉及多种细胞激活过程，包括细胞迁移、细胞间黏附、存活和凋亡。例如，在管状结构发育过程中，细胞迁移和细胞间黏附现象明显。然而，24 小时后，随着网络结构逐渐中断，细胞凋亡显著发生。该现象在内皮细胞和肿瘤细胞衍生的管状结构形成中均可见到。
目前研究表明，该检测方...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由 NCI R01 CA120659（RS）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| 生长因子减少型Matrigel | BD Biosciences | 47743-720 | |
| EBM2试剂盒 | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| Nikon ECLIPSE TS100显微镜 | Nikon Instruments |
参考文献
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