单分子下拉分析法用于蛋白质磷酸化检测：一种高通量定量细胞裂解液中蛋白质磷酸化的技术

摘要

来源：Bailey, E. M. 等，一种用于定量蛋白质磷酸化的优化单分子下拉检测方法。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种利用单分子下拉检测技术对蛋白质磷酸化进行高灵敏度定量的方法。通过聚乙二醇-生物素的功能化修饰以及标记抗体的使用，可特异性增强对磷酸化酪氨酸的检测。

方案

1. 使用生物素化抗体对抗体芯片进行功能化修饰

1. 配制以下溶液。
   1. T50 缓冲液，含 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 50 mM NaCl 的溶液。该溶液在室温下可稳定保存 1 个月。
   2. 在 T50 缓冲液中加入 0.1 mg/mL 的 BSA，制备 T50-BSA。配制后将溶液置于冰上保存。
   3. 用 1× PBS 配制 10 mg/mL 的硼氢化钠（NaBH₄）。该溶液需在使用前立即配制。
   4. 用 T50 缓冲液配制 0.2 mg/mL 的中性亲和素（NeutrAvidin）（参见材料表）。
      注意：NaBH₄ 为还原剂，具有可燃性。使用后必须用氮气吹扫容器，并将其存放于干燥器中。
2. 用生物素化抗体对芯片进行功能化修饰。
   1. 从冰箱中取出经 PEG-生物素修饰的芯片，在打开前将锥形管平衡至室温。将带有芯片的盖玻片正面朝上放置于铺有密封膜的 100 mm 组织培养皿（TC100）中。
      注意：尽量减少上方光照。所有溶液应在疏水性阵列所限定的方格内形成液滴。加入适量溶液以完全覆盖每个方格（通常为 10–15 µL），避免液体溢出限定区域。为快速移除液体，可使用连接至真空瓶的实验室真....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	MTC Bio	C2000
10 mM Tris-HCl，pH 7.4
10 mM Tris-HCl，pH 8.0 / 50 mM NaCl			T50 缓冲液
100 mm 组织培养皿	CELLTREAT	229620	用于储存经 piranha 处理的玻璃/阵列
15 mL 锥形管
16% 甲醛水溶液	Electron Microscopy Sciences	15710	危险品
50 mL 锥形管			功能化玻璃储存 / KOH 重复使用
8% 戊二醛水溶液	Electron Microscopy Sciences	16020	危险品
Alexa Fluor 647 NHS 酯	Thermo Fisher Scientific	A-20006
抗人 EGFR（胞外域）– 生物素	Leinco Technologies, Inc	E101
抗-p-Tyr 抗体 (PY99) Alexa Fluor 647	Santa Cruz Biotechnology	sc-7020 AF647
生物素-PEG	Laysan Bio	生物素-PEG-SVA，分子量 5,000
牛血清白蛋白	Gold Biotechnology	A-420-1	Tyrode's 缓冲液组分
盖玻片 24 × 60 #1.5	Electron Microscopy Sciences	63793
emCCD 相机	Andor iXon
Halt 磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物（100X）	Thermo Fisher Scientific	78446	裂解缓冲液组分
冰
Immersol 518F 浸油	Zeiss	444960-0000-000
实验室自建真空系统
Mix-n-Stain CF 染料抗体标记试剂盒	Biotium	92245
Nanogrid	Miraloma Tech
NeutrAvidin 生物素结合蛋白	Thermo Fisher Scientific	31000
氮气（压缩气体）
Olympus iX71 显微镜	Olympus
Parafilm M 密封膜	The Lab Depot	HS234526C
PBS，pH 7.4	Caisson Labs	PBL06
磷酸化 EGFR 受体（Tyr1068）(1H12) 小鼠单克隆抗体	Cell Signaling Technology	2236BF
四通道图像分光器	Photometrics	型号 QV2
Semrock 发射滤光片：蓝色（445/45 nm）、绿色（525/45 nm）、红色（600/37 nm）、远红（685/40 nm）	Semrock	LF405/488/561/635-4X4M-B-000
硼氢化钠（NaBH4）	Millipore Sigma	452874	危险品