来源：Bailey, E. M. 等，一种用于定量蛋白质磷酸化的优化单分子下拉检测方法。J. Vis. Exp. (2022)
本视频展示了一种利用单分子下拉检测技术对蛋白质磷酸化进行高灵敏度定量的方法。通过聚乙二醇-生物素的功能化修饰以及标记抗体的使用，可特异性增强对磷酸化酪氨酸的检测。
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方法文章
单分子下拉分析法用于蛋白质磷酸化检测：一种高通量定量细胞裂解液中蛋白质磷酸化的技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 使用生物素化抗体对抗体芯片进行功能化修饰
- 配制以下溶液。
- T50 缓冲液，含 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 50 mM NaCl 的溶液。该溶液在室温下可稳定保存 1 个月。
- 在 T50 缓冲液中加入 0.1 mg/mL 的 BSA，制备 T50-BSA。配制后将溶液置于冰上保存。
- 用 1× PBS 配制 10 mg/mL 的硼氢化钠（NaBH4）。该溶液需在使用前立即配制。
- 用 T50 缓冲液配制 0.2 mg/mL 的中性亲和素（NeutrAvidin）（参见材料表）。
注意：NaBH4 为还原剂，具有可燃性。使用后必须用氮气吹扫容器，并将其存放于干燥器中。
- 用生物素化抗体对芯片进行功能化修饰。
- 从冰箱中取出经 PEG-生物素修饰的芯片，在打开前将锥形管平衡至室温。将带有芯片的盖玻片正面朝上放置于铺有密封膜的 100 mm 组织培养皿（TC100）中。
注意：尽量减少上方光照。所有溶液应在疏水性阵列所限定的方格内形成液滴。加入适量溶液以完全覆盖每个方格（通常为 10–15 µL），避免液体溢出限定区域。为快速移除液体，可使用连接至真空瓶的实验室真空管线收集废液。NaBH4 废液应在化学通风橱中敞口放置 1 小时以释放气体后，再进行处理。NaBH4 处理可降低背景自发荧光，从而减少单分子检测中的假阳性信号。 - 在室温下，用含 10 mg/mL NaBH4 的 1× PBS 处理芯片的每个方格 4 分钟，随后用 PBS 洗涤 3 次。
- 在 T50 缓冲液中加入 0.2 mg/mL 的 NeutrAvidin，孵育每个方格 5 分钟；随后用 T50-BSA 洗涤 3 次。
注意：NeutrAvidin 可结合 PEG-生物素，从而为生物素化抗体提供结合位点。 - 在 T50-BSA 中加入 2 µg/mL 的生物素化目标蛋白特异性抗体，孵育每个方格 10 分钟；随后用 T50-BSA 洗涤 3 次。
注意：本方案使用生物素化抗 EGFR IgG（参见材料表）来捕获 EGFR-GFP。
- 从冰箱中取出经 PEG-生物素修饰的芯片，在打开前将锥形管平衡至室温。将带有芯片的盖玻片正面朝上放置于铺有密封膜的 100 mm 组织培养皿（TC100）中。
2. 从全细胞裂解液中进行目标蛋白的SiMPull实验
注意： 将功能化的 SiMPull 芯片 TC100 培养皿置于冰上，直至完成 SiMPull 制备的后续步骤。此步骤是从总蛋白裂解液中进行目标蛋白（POI）的下拉。裂解液在解冻后不得重复使用。
- 配制以下溶液。
- 在1× PBS中配制4%多聚甲醛（PFA）/0.1%戊二醛（GA）。
注意：PFA和GA为有毒化学固定剂，且可能具有致癌性。操作时需穿戴个人防护装备（PPE），并根据当地法规和指南将化学品作为危险废物处理。 - 配制10 mM Tris-HCl，pH 7.4。
- 在1× PBS中配制4%多聚甲醛（PFA）/0.1%戊二醛（GA）。
- 通过轻柔吹打使裂解液解冻并混匀，置于冰上保存。
- 将1 µL裂解液加入100 µL预冷的T50-BSA/PPI中进行稀释。
注意：如有需要，可通过在阵列上应用不同稀释倍数来确定总蛋白裂解液的合适稀释比例。每单位阵列面积上SiMPull受体的最佳密度为0.04–0.08/µm2。 - 将裂解液在阵列上孵育10分钟，随后用预冷的T50-BSA/PPI洗涤四次。
- 将AF647标记的抗磷酸化酪氨酸抗体（见材料表）用预冷的T50-BSA/PPI稀释后，加入阵列中孵育1小时。
注意：本实验方案中使用广谱抗-pTyr（PY99）-AF647 IgG来识别磷酸化的EGFR-GFP群体。直接使用荧光标记的一抗可避免使用二抗，从而增加标记选择性并提高实验结果的一致性。荧光标记抗体可从商业来源获得；若无市售产品，也可采用标准生物偶联技术进行定制标记，相关商业偶联试剂盒亦可获取。每一批次的荧光标记抗体均需通过SiMPull实验测试其最佳标记条件，测定剂量-反应曲线并确定饱和点。 - 用预冷的T50-BSA洗涤六次，总时长6–8分钟。
- 用预冷的1× PBS洗涤两次。
- 将阵列与4% PFA/0.1% GA溶液孵育10分钟，以防止抗体解离。
- 用10 mM Tris-HCl，pH 7.4/PBS洗涤两次，每次5分钟，以灭活固定剂。
注意：对于使用多种抗体的实验（例如检测多个磷酸化酪氨酸位点），需重复步骤2.5–2.9。
3. 图像采集
注意：单分子成像使用150倍TIRF物镜和图像分光器完成，图像分光器将每个光谱通道捕获到emCCD相机的特定象限（参见材料表）。首先获取校准图像，以便利用纳米图案化通道对准网格（nanogrid）进行通道配准和相机增益校准，该网格包含20 × 20阵列的200 ± 50 nm孔，孔间距离为3 ± 1 µm（总尺寸约60 µm × 60 µm）。
- 按照以下步骤执行通道配准。
注意：准确的通道配准对于正确计算发射体的共定位至关重要。此步骤非常关键。- 清洁油镜并在物镜上滴加一滴镜油。将纳米网格放置在载物台上进行成像。使用透射白光，聚焦到网格图案上。
注意：纳米网格的图像通过透射光获取，透射光穿过纳米网格后被所有光谱通道检测到。或者，也可使用多色荧光微球，其在每个通道中发射可被检测的荧光。图像采集需根据每台显微镜的具体配置进行优化。 - 采集20幅网格图像序列。确保像素未饱和。将图像序列保存为“Fiducial”。
- 使纳米网格离焦以形成艾里斑图案。采集20幅图像序列用于增益校准。将图像保存为“Gain”。
- 通过阻断所有进入相机的光线，采集20幅图像序列以获取相机偏移值。将图像保存为“Background”。
- 清洁油镜并在物镜上滴加一滴镜油。将纳米网格放置在载物台上进行成像。使用透射白光，聚焦到网格图案上。
- 采集SiMPull图像。
注意：在对盖玻片阵列成像前，需将Tris溶液更换为T50-BSA，并将阵列平衡至室温。- 清洁油镜并在物镜上追加镜油。将盖玻片阵列牢固固定在显微镜载物台上。
- 优化每种荧光染料的激发光功率、全内反射角（TIRF）及相机积分时间。目标是在最小化样品光漂白的同时获得最高的信噪比。记录激光功率，以保证后续测量的一致性。
注意：本研究中，远红通道的曝光时间为300 ms，绿色通道为1 s。642 nm激光器的功率约为500 µW，488 nm激光器的功率为860 µW，均在管镜前测量。 - 对每个样品采集图像。应先成像远红通道，再依次成像波长较短的各荧光通道，以减少光漂白。由于每个样品使用的体积较小，需每30–45分钟检查缓冲液液面，并根据需要补充。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl，pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl，pH 8.0 / 50 mM NaCl | T50 缓冲液 | ||
| 100 mm 组织培养皿 | CELLTREAT | 229620 | 用于储存经 piranha 处理的玻璃/阵列 |
| 15 mL 锥形管 | |||
| 16% 甲醛水溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 危险品 |
| 50 mL 锥形管 | 功能化玻璃储存 / KOH 重复使用 | ||
| 8% 戊二醛水溶液 | Electron Microscopy Sciences | 16020 | 危险品 |
| Alexa Fluor 647 NHS 酯 | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| 抗人 EGFR（胞外域）– 生物素 | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| 抗-p-Tyr 抗体 (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| 生物素-PEG | Laysan Bio | 生物素-PEG-SVA，分子量 5,000 | |
| 牛血清白蛋白 | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's 缓冲液组分 |
| 盖玻片 24 × 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| emCCD 相机 | Andor iXon | ||
| Halt 磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物（100X） | Thermo Fisher Scientific | 78446 | 裂解缓冲液组分 |
| 冰 | |||
| Immersol 518F 浸油 | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| 实验室自建真空系统 | |||
| Mix-n-Stain CF 染料抗体标记试剂盒 | Biotium | 92245 | |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin 生物素结合蛋白 | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| 氮气（压缩气体） | |||
| Olympus iX71 显微镜 | Olympus | ||
| Parafilm M 密封膜 | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS，pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| 磷酸化 EGFR 受体（Tyr1068）(1H12) 小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| 四通道图像分光器 | Photometrics | 型号 QV2 | |
| Semrock 发射滤光片：蓝色（445/45 nm）、绿色（525/45 nm）、红色（600/37 nm）、远红（685/40 nm） | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| 硼氢化钠（NaBH4） | Millipore Sigma | 452874 | 危险品 |
