用于蛋白质磷酸化分析的单分子沉降测定:一种定量细胞裂解物中蛋白质磷酸化的高通量技术

Abstract

来源:Bailey， EM et al.， 用于蛋白质磷酸化定量的优化单分子沉降测定。J. Vis. Exp. （2022 年）

该视频演示了一种使用单分子沉降测定法的灵敏蛋白质磷酸化定量技术。聚乙二醇-生物素的功能化和标记抗体的使用提高了磷酸化酪氨酸的特异性检测。

Protocol

1. 使用生物素化抗体对阵列进行功能化

1. 准备以下解决方案。
   1. T50 缓冲液，10 mM Tris-HCl （pH 8.0） 和 50 mM NaCl 溶液。该溶液在 RT 下可稳定保存 1 个月。
   2. T50-BSA，通过在 T50 缓冲液中补充 0.1 mg/mL 的 BSA。将准备好的溶液放在冰上。
   3. 1x PBS 中的 10 mg/mL 硼氢化钠 （NaBH₄）。使用前立即准备。
   4. 0.2 mg/mL 中性亲和素（参见材料表）在 T50 缓冲液中><。 谨慎: NaBH₄ 是一种还原剂，易燃。使用后务必用氮气吹扫容器，并将其存放在干燥器中。
2. 用生物素化抗体对阵列进行功能化。
   1. 从冰箱中取出 PEG-生物素功能化阵列，并在打开前将锥形管平衡至 RT。将盖玻片（阵列朝上）放在密封膜衬有 100 mm 组织培养 （TC100） 培养皿上。
      注意:尽量减少头顶照明。所有溶液都应在疏水阵列定义的方块上"珠状"。添加适当体积的溶液以完全覆盖每个方块（通常为 10-15 μL），并且不要让液体溢出规定的空间。要快速去除液体，请使用连接到真空瓶的内部真空管线来捕获废液。在处理之前，通过将管子在化学通风橱中保持打开，让 NaBH₄ 脱气 1 小时。NaBH₄ 处理对于减少背景自发荧光是必要的，从而减少假阳性单分子检测。
   2. 在 RT 下用 10 mg/mL NaBH₄ 的 1x PBS 溶液处理阵列的每个方块 4 分钟。用 PBS 洗涤 3 次。
   3. 将每个方块与 0.2 mg/mL 的 NeutrAvidin 在 T50 中孵育 5 分钟。用 T50-BSA 洗涤 3 次><。 注意:中性亲和素与 PEG-生物素结合，并为生物素化抗体提供结合位点。
   4. 用 2 μg/mL 的 T50-BSA 生物素化 POI 特异性抗体孵育每个方块 10 分钟;用 T50-BSA 洗涤 3 次><。 注意:本方案使用生物素化的抗 EGFR IgG（参见材料表）来捕获 EGFR-GFP。

2. 来自全细胞裂解物的 POI 的 SiMPull

注意:将功能化 SiMPull 阵列的 TC100 培养皿放在冰上，进行 SiMPull 制备的剩余部分。此步骤是从总蛋白裂解物中拉下 POI。解冻后，裂解物不得重复使用。

1. 准备以下解决方案。
   1. 在 1x PB>谨慎:PFA 和 GA 是有毒的化学固定剂和潜在的致癌物。穿戴个人防护装备。根据当地法规和指南将化学品作为危险废物处理。
   2. 制备 10 mM Tris-HCl，pH 7.4。
2. 通过轻轻上下吹打来解冻并混合裂解物。保持在冰上。
3. 将 1 μL 裂解物稀释到 100 μL 冰冷的 T50-BSA/PPI.
   中 注意:如果需要，通过对阵列进行一系列稀释来确定总蛋白裂解物的适当稀释因子。每个阵列面积的 SiMPull 受体的最佳密度为 0.04-0.08/μm²。
4. 将裂解物在阵列上孵育 10 分钟;然后用冰冷的 T50-BSA/PPI 洗涤四次。
5. 在冰冷的 T50-BSA/PPI 中稀释 AF647 偶联的抗磷酸酪氨酸抗体（参见材料表），并在阵列上孵育 1 小时
   注意:在本方案中，使用泛抗 pTyr （PY99）-AF647 IgG 来鉴定 EGFR-GFP 的磷酸化群体。使用直接标记的抗体无需二抗，增加了标记选项并提高了结果的一致性。荧光标记抗体可以从商业来源获得。如果无法在市场上买到抗体，可以使用标准生物偶联技术对抗体进行定制标记，并且可以使用市售生物偶联试剂盒。每批荧光标记抗体都需要通过执行 SiMPull 来测量剂量曲线并找到饱和点，以测试最佳标记条件。
6. 用冰冷的 T50-BSA 洗涤 6 次，总共 6-8 分钟。
7. 用冰冷的 1x PBS 洗涤两次。
8. 将阵列与 4% PFA/0.1% GA 溶液孵育 10 分钟，以防止抗体解离。
9. 用 10 mM Tris-HCl（pH 7.4/PBS）洗涤两次，每次 5 分钟，以灭活固定剂><。 注意:对于使用多种抗体的实验（例如，检测多个磷酸酪氨酸位点），请重复步骤 2.5-2.9。

3. 图像采集

注意:使用 150 倍 TIRF 物镜和图像分路器进行单分子图像采集，该分路器可捕获 emCCD 相机特定象限中的每个光谱通道（参见材料表）。首先采集校准图像，以便使用纳米图案化通道对齐网格（纳米网格）进行通道配准和相机增益校准，该网格包含 20 x 20 个 200 ± 50 nm 孔阵列，孔内距离为 3 ± 1 μm（总尺寸为 ~60 μm × 60 μm）。

1. 按照以下步骤执行频道注册。
   注意:需要精确的通道配准才能正确计算发声体的共定位。此步骤至关重要。
   1. 清洁机油物镜并在物镜上滴一滴油。将纳米网格放在载物台上进行成像。使用透射白光，聚焦于网格图案。
      注意:带有纳米网格的图像是使用透射光获取的，透射光穿过纳米网格并在所有光谱通道中被检测到。或者，可以使用发射在每个通道中检测到的荧光的多荧光珠。需要根据每种显微镜设置对图像采集进行优化。
   2. 获取网格的 20 张系列图像。确保像素不饱和。将图像系列另存为 "Fiducial"（基准）
   3. 散焦纳米网格以创建 Airy 图案。采集一系列 20 张图像以进行增益校准。将图像另存为 "Gain"。
   4. 通过阻挡所有光线进入相机，获取一系列 20 张图像以进行相机偏移。将图像另存为 "Background"。
2. 获取 SiMPull images.
   注意:在对盖玻片阵列成像之前，将 Tris 溶液交换为 T50-BSA 并将阵列平衡至 RT。
   1. 清洁物镜上的油，并在物镜上沉积额外的油。将盖玻片阵列固定在显微镜载物台上。
   2. 优化每个荧光基团的激发功率、TIRF 角度和相机积分时间。目标是实现最高的信噪比，同时最大限度地减少样品的光漂白。记录激光功率，以便在将来的测量中保持一致。
      注意:本研究对远红通道使用了 300 ms 的曝光时间，对绿色通道使用了 1 s 的曝光时间。642 nm 激光器的激光功率约为 500 μW，而 488 nm 激光器的激光功率为 860 μW，在镜筒透镜之前测量。
   3. 采集每个样品的图像。首先对远红通道进行成像，然后对每个较低波长的荧光团进行成像，以减少光漂白。由于每个样品使用的体积较小，因此每 30-45 分钟检查一次缓冲液水平，并根据需要补充。

Materials