平面支撑脂双层实验：一种基于显微镜的体外技术，用于研究Septin在生物膜模拟物上的组装

摘要

来源：Curtis, B. N. 等. 膜上肌动蛋白组装的重建以研究其生物物理特性与功能。J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，我们演示一种在玻璃支撑脂双层上研究 septin 组织结构的方法 体外 使用全内反射荧光显微镜。

方案

1. 平面脂双层

1. 载玻片的等离子清洗
   注意： 等离子清洗可去除有机污染物，并提高玻璃表面的亲水性，从而确保脂质有效吸附。以下步骤可能因所使用的等离子清洗仪和玻璃盖玻片的不同而需要调整或优化。
   1. 使用氧气对等离子清洗仪进行5分钟的吹扫，以清除管路和腔室中的空气。此步骤可确保在运行等离子清洗时，管路和腔室内主要为氧气，从而获得更一致的双层膜制备效果。
   2. 在吹扫的同时，用惰性气体（如N₂或Ar）吹拂微型玻璃盖玻片表面，以去除灰尘和颗粒物。
      可选： 可通过在盖玻片两面喷洒100%异丙醇后用水冲洗的方式进行清洗。重复异丙醇-水清洗3次，然后用N₂气流吹干。
   3. 将干燥的玻璃盖玻片整齐排列于陶瓷支架中。将支架置于等离子腔室后部，使盖玻片与腔室长边平行（以确保等离子清洗过程中盖玻片保持稳定）。以最大功率在氧气环境中运行等离子清洗仪15分钟。
2. 反应腔室的制备
   注意： 此处描述的方法使用自制的塑料PCR管腔室以容纳反应液体积，但其他低吸附性材料（如硅胶小室）也可能适用。
   1. 使用剃刀刀片或剪刀，在0.2 mL PCR管磨砂部分下方切去管帽（图1）。
   2. 在PCR管边缘涂抹紫外光活化胶水，避免胶水进入管内。轻轻将PCR管胶面朝下置于经等离子清洗的盖玻片中央。
      注意： 为避免胶水进入腔室内，应使用最少必要量的胶水实现密封，并在涂胶后立即进行紫外照射处理，过程中避免触碰或移动腔室。
   3. 将腔室置于长波长紫外光下照射5–7分钟，以固化胶水。
3. 双层膜的形成
   注意： 此步骤应使用单一分散的小单层囊泡（SUVs）以实现高效的双层膜形成。表1列出了双层膜形成过程中所用所有缓冲液的配方，包括储备液和终浓度缓冲液。
   1. 向反应孔中加入40 µL支持性脂质双层缓冲液（SLBB：300 mM KCl，20 mM HEPES，pH 7.4，1 mM MgCl₂；表1）、10 µL 5 mM SUVs和1 µL 100 mM CaCl₂。轻轻左右摇动腔室以破坏SUVs结构，随后在37 °C孵育20分钟。
      注意： 为减少蒸发，应将样品置于加盖的培养皿中，并在皿内放置湿润的擦拭纸。
4. 洗去多余脂质
   注意： 此步骤用于去除多余的SUVs，并实现缓冲液的更换。清洗过程中务必避免移液枪头刮擦双层膜表面；若玻璃表面暴露，septins及其他多种蛋白质将不可逆地结合于其上，从而降低有效蛋白浓度。
   1. 孵育结束后，用150 µL SLBB缓冲液对双层膜进行6次冲洗，每次冲洗时上下吹打混匀，注意避免产生气泡。
      注意：直接将150 µL缓冲液加入已存在的50 µL缓冲液和SUVs混合液中，使反应孔内总体积达到200 µL。
   2. 当准备开始与septins或其他目标蛋白孵育时，用150 µL反应缓冲液（RXN：33.3 mM KCl，50 mM HEPES，pH 7.4，1.4 mg/mL BSA，0.14%甲基纤维素，1 mM BME）对双层膜进行6次清洗。
      注意：为获得最佳结果，建议现配反应缓冲液，并在反应孔内混匀时格外小心，避免产生气泡。
   3. 最后一次清洗后，移除125 µL反应缓冲液，保留75 µL于孔内。加入25 µL用septin储存缓冲液（SSB：300 mM KCl，50 mM HEPES，pH 7.4，1 mM BME）稀释至所需浓度的septins溶液，并通过全内反射荧光显微镜（TIRF）进行成像。
      注意： 首次建立该实验体系或引入新的脂质组成时，建议通过光漂白后荧光恢复（FRAP）实验确认脂质在表面是否自由扩散。尽管不同脂质组成的恢复速率会有所不同，且天然低于游离系统，但脂质不应完全静止不动。

表1：制备支撑脂质双层及反应所用缓冲液的组分。 表中列出了加入缓冲液中的各种储备液的体积以及各组分的最终浓度。SLB 和 PRB 可在室温下保存，并可在不同实验间重复使用。反应缓冲液和 SSB 需在每次实验前新鲜配制。

支撑脂双层缓冲液（SLBB）
母液	体积	终浓度
2 M KCl	1.5 mL	300 mM
1 M HEPES	200 µL	20 mM
500 mM MgCl2	20 µL	1 mM
水	8 mL
预反应缓冲液（PRB）
母液	体积	终浓度
2 M KCl	166 µL	33.3 mM
1 M HEPES	500 µL	50 mM
水	9.33 mL
反应缓冲液
母液	体积	终浓度
2 M KCl	166 µL	33.3 mM
1 M HEPES	300 µL	50 mM
10 mg/mL BSA	1.39 mL	1.39 mg/mL
1% 甲基纤维素	1.39 mL	0.0014
水	加至 10 mL
BME	0.7 µL	1 mM
Septin 储存缓冲液（SSB）
母液	体积	终浓度
2 M KCl	1.5 mL	300 mM
1 M HEPES	500 µL	50 mM
水	加至 10 mL
BME	0.7 µL	1 mM

结果

图1：反应腔室设置示意图。 为制备定制腔室，需在0.2 mL PCR管开始变细处及管盖处（红色虚线）进行切割。将切割后未切断的管口边缘涂上一层薄薄的紫外光活化胶（蓝色），然后将涂胶面朝下放置于盖玻片上。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL 带平盖 PCR 管，透明	Watson	137-211C(EX)
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
氯化镁	VWR	7791-18-6
甲基纤维素 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
用于平面双层膜的微型玻璃盖玻片	Matsunami	已停产	22x22
光学胶	Norland Thorlabs	NOA 68	适用于玻璃或塑料的柔性胶粘剂
等离子清洗仪	Plasma Etch	PE-25	电压：120V，60Hz；电流：15 AMPS
氯化钾	VWR	0395-1kg
紫外灯	Spectroline	ENF-260C	115 伏，60 Hz，0.20 AMPS
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4612-25G
β-巯基乙醇（BME）	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
卵磷脂罗丹明 PE	Avanti Polar Lipids	810146