来源：Curtis, B. N. 等，在膜上重建 Septin 组装以研究其生物物理特性与功能。J. Vis. Exp. (2022)。
本视频介绍了在涂有脂质双层的微球上研究 septin 蛋白组装的技术。该技术有助于理解蛋白质在曲面上的曲率依赖性组装行为。
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方法文章
球形支撑脂双层实验：一种在微球上观察Septin组装的技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 球形支撑脂双层
注意：本方案使用悬浮于超纯水中、浓度为10%的二氧化硅微球。在进行蛋白质组装动力学参数相关研究时，严格控制不同实验之间的总膜表面积及曲率至关重要。 表1列出了为维持5 mm2 总膜表面积所需的微球和缓冲液体积的校正值。
- 双层膜的形成
注意： 与平面双层膜类似，高质量的小单层囊泡（SUVs）对于稳定双层膜的形成至关重要。 表1 列出了使用不同直径微珠时，为获得5 mm2 的最终表面积，所需10%密度溶液中的微珠体积及其相应的SLBB体积。- 二氧化硅微球（也称为微珠）容易沉降并聚集；为混匀微珠并打散任何团块，先涡旋振荡瓶体15秒，然后水浴超声1分钟，再涡旋15秒。
- 在0.5 mL低吸附微量离心管中，将适当体积的微珠（表1）与相应体积的SLBB以及10 µL的5 mM SUVs混合。
- 将微珠-脂质混合物在室温下以翻转方式轻轻摇动1小时。确保该孵育过程在旋转仪上进行，以防止沉降。
- 在PEG修饰的盖玻片上制备反应腔室
注意： 与平面双层膜类似，本实验使用由塑料PCR管自制的腔室来承载反应液体积，但其他低吸附材料（如硅胶小室）也可能同样有效。- 在微珠摇动的同时，将一张PEG修饰的盖玻片在室温下解冻。按说明裁剪一个0.2 mL的PCR管并将其粘附至盖玻片上。对于24 mm × 50 mm的载玻片，一张玻片上最多可容纳10个腔室。
注意： 本方案使用预先制备的24 mm × 50 mm PEG修饰玻璃盖玻片。简而言之，玻璃盖玻片通过在丙酮、甲醇和3 M KOH中依次超声清洗进行彻底清洁，随后用n-2-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷进行功能化修饰，并共价连接至mPEG琥珀酰亚胺戊酸酯。制备完成的PEG修饰盖玻片真空密封后于−80 °C保存。尽管此处推荐使用PEG修饰玻璃盖玻片，其他钝化方法（如BSA或聚-L-赖氨酸处理）也可能有效。
- 在微珠摇动的同时，将一张PEG修饰的盖玻片在室温下解冻。按说明裁剪一个0.2 mL的PCR管并将其粘附至盖玻片上。对于24 mm × 50 mm的载玻片，一张玻片上最多可容纳10个腔室。
- 洗去多余脂质
注意： 此步骤旨在去除多余的SUVs并完成缓冲液置换。使用预反应缓冲液（PRB：33.3 mM KCl，50 mM HEPES，pH 7.4）对微珠进行总共4次洗涤。 表2 列出了不同直径微珠所需的离心相对离心力（RCF）。- 按照指定的RCF离心30秒（表2）。若使用多种尺寸的微珠，请在轮到某一种微珠洗涤前继续保持其摇动状态。
注意： 为节省时间而将较大微珠与较小微珠以较小微珠的沉降速度一同离心是不可取的，这可能导致微珠相互粘连，破坏双层膜的完整性。 - 第一次离心后，移除50 µL上清液并加入200 µL PRB。第二和第三次离心后，各移除200 µL上清液并加入200 µL PRB。第四次离心后，移除200 µL上清液并加入220 µL PRB。每次洗涤均需用力吹打混匀。
注意： 最终重悬体积与洗涤体积不同。在脂质孵育后切勿涡旋微珠，以免在双层膜中产生空隙。为避免在处理其他尺寸微珠或设置实验其他部分时发生沉降，请将微珠混合物重新放回翻转式旋转仪上。
- 按照指定的RCF离心30秒（表2）。若使用多种尺寸的微珠，请在轮到某一种微珠洗涤前继续保持其摇动状态。
- 准备反应
- 若进行多种微珠尺寸的竞争实验，将各尺寸微珠等体积混合，制成1:1的混合液。然后取29 µL所需微珠混合液（或单一尺寸微珠）与721 µL RXN缓冲液混合。
注意： 每一步均需使用移液器充分混匀微珠，以避免微珠形成致密团块；这有助于实现更均匀的微珠分布和准确的总表面积。 - 将75 µL稀释后的微珠与25 µL用SSB稀释的蛋白加入各孔中。
注意： 作者通常在1–50 nM浓度范围内对酵母Septin复合物进行成像。 - 若需测量Septin的稳态状态，则在室温下孵育1小时后，使用近全内反射（near-TIRF）或共聚焦显微镜进行成像。
注意： 该反应设计旨在保持反应体系中膜的总表面积为5 mm2 ，并使最终反应条件达到100 mM KCl、50 mM HEPES、1 mg/mL BSA、0.1%甲基纤维素和1 mM BME。
- 若进行多种微珠尺寸的竞争实验，将各尺寸微珠等体积混合，制成1:1的混合液。然后取29 µL所需微珠混合液（或单一尺寸微珠）与721 µL RXN缓冲液混合。
表1：微球的归一化体积。 为了保持每种粒径微珠的表面积相等，并确保不同实验间总膜表面积一致，计算了每种粒径微珠及缓冲液体积，以实现总表面积的归一化。
| 微珠直径 (µm) | 充分混合的微珠体积 (µL) | SLB 缓冲液体积 (µL) | SUV 体积 (µL) |
| 6.46 | 8.94 | 61.1 | 10 |
| 5.06 | 7 | 63 | 10 |
| 3.17 | 4.39 | 65.6 | 10 |
| 0.96 | 1.33 | 68.7 | 10 |
| 0.54 | 0.75 | 69.3 | 10 |
| 0.31 | 0.43 | 69.6 | 10 |
表2：不同直径微球的沉降速度。 针对每种微球直径，所示的最小沉降速度用于沉淀微球，以洗去未结合的脂质体
| 微珠直径 (µm) | 沉降速度 (RCF) |
| 0.31 | 4.5 |
| 0.54 | 4.5 |
| 0.96 | 2.3 |
| 3.17 | 0.8 |
| 5.06 | 0.3 |
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL 平盖 PCR 管，天然色 | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL 低吸附管 | USA Scientific | 1405-2600 | |
| β-巯基乙醇（BME） | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| 用于制备 PEG 修饰盖玻片的盖玻片 | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE 盖玻片 24x50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| 卵磷脂罗丹明 PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| 甲基纤维素 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| 迷你离心机 | |||
| 非功能化二氧化硅微球 | Bangs Laboratories, Inc. | 取决于粒径：SS0200*-SS0500* | 水相悬浮液中的二氧化硅微球 |
| 光学胶 | Norland Thorlabs | NOA 68 | 适用于玻璃或塑料的柔性胶粘剂 |
| 氯化钾 | VWR | 0395-1kg | |
| 超声波清洗仪 | Branson | 1510R-MT | Bransonic 超声波清洗机，50-60 Hz，输出功率：70 W |
| 大豆磷脂酰肌醇（Soy PI） | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 22331 | |
| 紫外灯 | Spectroline | ENF-260C | 115 伏，60 Hz，0.20 安培 |
