alamarBlue 检测：一种灵敏的荧光法，用于筛选人工泪液配方对人角膜上皮细胞代谢活性的细胞毒性作用

摘要

来源：Rangarajan, R. 等. 人工泪液配方在干燥暴露后对人角膜上皮细胞代谢活性的影响. J. Vis. Exp. (2020)

本视频介绍了一种 体外 使用基于刃天青的Alamar Blue溶液，通过荧光测定法评估人工泪液配方对角膜上皮细胞代谢活性的影响。无毒配方可维持细胞处于健康且代谢活跃的状态，促进刃天青还原为高度荧光的试卤灵。

方案

1. 人角膜上皮细胞培养

1. 在胶原蛋白包被的75 cm²培养瓶中，加入20 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基/F-12营养混合物（DMEM/F12），于37 °C、5% CO₂条件下培养永生化人角膜上皮细胞（HCEC）。
   注意：无需振荡培养。
2. 每2−3天更换一次培养基。

2. 测试用细胞的制备

1. 当细胞接近融合时，移除培养基。
2. 向每个 75 cm² 培养瓶中加入 4−6 mL 细胞解离液。在 37 °C 下孵育细胞，直至细胞脱落（约 20−30 分钟），期间定期在显微镜下观察。
3. 向每个 75 cm² 培养瓶中加入 2−6 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM/F12 培养基。
4. 将培养瓶中的内容物转移至 50 mL 离心管中。
5. 在 450−500 × g 条件下离心 5 分钟。用移液器吸除上清液，并将细胞重悬于预热的培养基中。
6. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。计算含有 1 × 10⁵ 个细胞的培养基体积。
7. 将 1 × 10⁵ 个细胞接种至每孔 48 孔胶原蛋白-1 包被的培养板中。向每孔中加入足够量的培养基，使每孔最终培养基体积为 0.5 mL 含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基。
   注意：人工泪液配方可能引起细胞毒性，可通过人角膜上皮细胞（HCEC）代谢活性的降低来检测。数据的一致性依赖于接种时每孔加入相同数量的 HCEC。推荐用于 48 孔板的接种浓度为 1 × 10⁵ 个细胞/孔。由于哺乳动物细胞在重悬后可能在离心管中沉降，因此在接种过程中建议频繁振荡重悬细胞，以确保细胞悬液中的 HCEC 分布均匀。
8. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。

3. 无干燥处理方案

1. 对照程序
   1. 孵育24小时后，从培养板中移除培养基。
   2. 立即加入150 µL待测制剂和培养基对照溶液。
   3. 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟。
   4. 从细胞中移除待测溶液。
   5. 加入0.5 mL 10%代谢染料溶液，以检测代谢活性。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育4小时。
   6. 4小时孵育结束后，从每个孔中移除100 µL代谢染料溶液，并将每100 µL转移至一块96孔板的对应孔中。
   7. 使用荧光酶标仪（材料表）测定各孔的荧光强度。激发波长设为540 nm，发射波长设为590 nm。
2. 无干燥处理方案（恢复程序）
   1. 重复步骤3.1.1−3.1.4。
   2. 向每个孔中加入0.5 mL DMEM/F12培养基。
   3. 将一组培养物在37 °C、5% CO₂条件下孵育18小时。
   4. 移除培养基，加入0.5 mL 10%代谢染料溶液。重复步骤3.1.6和3.1.7。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96 孔板	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Corning 48 孔板	Corning	354505	此为 BioCoat 品牌胶原蛋白包被板
含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES 的 DMEM/F12 培养基	Gibco	11039-021	该培养基中不含酚红
胎牛血清	Hycone	SH30396.03
人角膜上皮细胞	渥太华大学	N/A	来自加拿大渥太华眼科研究所 M. Griffith 博士实验室的 SV40 永生化人角膜上皮细胞，已进行表征：Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. 利用细胞系构建功能性人角膜等效物. Science. 1999;286:2169–72.
TrypLE Express（细胞解离溶液）	Fisher Scientific	12605036
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	可检测 280 - 700 nm 范围内的荧光信号（本实验使用 540/590）