来源：Qvit, N.，等。利用场效应生物传感技术探究分子伴侣Hsp90与其客户蛋白激酶Cdc37之间的生物分子相互作用。J. Vis. Exp. (2022)。
在本视频中，我们介绍用于检测和定量蛋白质-蛋白质相互作用的场效应生物传感（FEB）技术。固定在石墨烯生物传感器上的目标蛋白质与溶液中的分析物蛋白质发生相互作用，导致FEB系统中电流发生变化。这种电学信号的变化反映了蛋白质之间的结合亲和力。
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方法文章
基于石墨烯生物传感器的场效应生物传感技术检测蛋白质-蛋白质相互作用
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
注意：本研究中使用的重组蛋白 Hsp90 和 Cdc37 均为商业途径获得（见材料表）。
1. 芯片活化
注意： 实验中使用的所有材料均列在材料表中。所有配制的溶液均需通过无菌的 0.2 μm 滤器过滤。
- 在15 mL离心管中，将2 mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）加入2.5 mL的1 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液（pH = 6.0）中，配制EDC溶液。另取一个15 mL离心管，将6 mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（sulfo-NHS）加入2.5 mL的1 M MES缓冲液（pH = 6.0）中，配制sulfo-NHS溶液。 将上述每种溶液各取50 µL分装至独立离心管中，于-20 °C保存以备后续使用。
- 用移液器吸取等体积的EDC溶液和sulfo-NHS溶液（50 µL EDC + 50 µL sulfo-NHS），上下吹打混匀（勿涡旋振荡）。
注意： EDC/sulfo-NHS混合溶液必须在30分钟内使用，以确保有效的交联反应，实现芯片的正确功能化。 - 将公司提供的生物传感器芯片（5.7 cm × 2.4 cm；参见材料表）放入带盖玻璃培养皿中。建议所有芯片活化相关的功能化步骤均在该培养皿中进行。向生物传感器芯片表面加入50 µL的1 M MES缓冲液（pH = 6.0），室温孵育1分钟，随后吸除缓冲液。
- 立即向传感器芯片表面加入50 µL EDC/sulfo-NHS溶液 。盖上培养皿盖，于室温孵育15分钟 。 吸除芯片上的EDC/sulfo-NHS溶液。
- 用50 µL的1 M MES缓冲液（pH = 6.0）冲洗芯片一次，随后吸除MES缓冲液。
2. 目标蛋白的固定
- 用缓冲液冲洗芯片 2 次 50 µL 的 1x PBS（pH = 7.4）。从芯片中吸除 PBS，然后加入 靶分子，Hsp90（50 µL；500 nM
注意： 缓冲液不匹配可能会破坏整个实验；因此，在实验前必须确保目标分子所处的缓冲液与校准所用的缓冲液相同（例如，1× PBS（pH = 7.4））。如有需要，可在实验前通过过夜透析进行缓冲液置换。本实验中，重组蛋白Hsp90和Cdc37均在1× PBS（pH = 7.4）中进行过夜透析（见 材料清单) 并在 4 °C 下进行适当的缓冲液置换。目标物质（本例中为 Hsp90）的浓度可根据不同的实验方案及目标物质的性质（蛋白质/多肽/配体）而变化。 - 盖上玻璃培养皿，室温孵育 30 分钟。吸除含有目标分子的溶液，用 50 µL 的 1x PBS（pH = 7.4）。从芯片中吸除 1x PBS（pH = 7.4）溶液。
- 添加 向芯片中加入50 µL淬灭液1（3.9 mM 氨基-PEG5-醇溶于1×PBS（pH = 7.4））溶液。 盖上玻璃培养皿 室温孵育15分钟。从芯片中吸除Quench 1溶液。
- 添加 向芯片中加入50 µL淬灭液2（1 M乙醇胺（pH = 8.5）），盖上玻璃培养皿 室温孵育15分钟。从芯片上吸除Quench 2溶液，用50 µL 1×PBS冲洗芯片5次，最后一次保留PBS液滴在传感器上。
3. 准备分析物样品
- 在所需浓度范围内配制Cdc37的分析物稀释系列。在第一次实验中，使用的浓度如下：25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM、800 nM、1,000 nM、2,000 nM、3,000 nM 和 5,000 nM。在第二次实验中，使用了另一组浓度，范围从 0.4 nM 到 200 nM。
- 设计实验时应包含至少八个不同的分析物浓度，以获得可靠的KD值。用与校准和靶蛋白相同的缓冲液配制分析物蛋白的不同稀释液；此处为1x PBS（pH = 7.4）。
4. 将活化的生物传感器芯片装入FEB装置
注意：FEB 设备由一个带有 LED 指示灯的读取器和一个用于插入生物传感器芯片的卡盒组成。
- 靶蛋白固定后，将活化芯片插入与设备相连的卡盒中 通过 USB 连接到计算机。芯片插入后，读取器上的绿色 LED 灯将亮起，表明 FEB 设备已准备就绪，可以开始实验。安装自动化软件（参见 材料表由公司提供的计算机软件，连接至FEB设备，用于逐步监控实验过程，具体步骤如下所述。
5. 运行实验
- 点击自动化软件中的 运行实验 模块，并选择 10 个浓度点带再生 或其他所需实验方案。填写以下信息： 操作者姓名、实验 名称、日期（例如：Yana，Hsp90 + Cdc37，2021.03.14）；再生缓冲液（例如：PBS 缓冲液）；固定的靶标（例如：Hsp90）；溶液中的分析物（例如：Cdc37）。
- 点击软件界面上显示的 开始实验 按钮，并按照自动化软件提示的以下步骤进行操作。
注意：该软件完全自动化，操作界面友好，可引导用户逐步完成整个实验。在实验的每一步，屏幕上将弹出提示窗口，指导下一步操作。软件将依次为每个分析物浓度提供重复步骤的指令，包括校准、分析物结合、解离、再生和清洗（5 次）。 - 执行仪器校准。为此，从芯片中吸出残留的 PBS 溶液，并加入 50 µL 校准缓冲液（1× PBS；pH = 7.4）。点击 继续 按钮，等待 5 分钟直至校准步骤完成。软件将显示校准步骤的终点时间（5 分钟），并发出警报提示后续操作。
- 接下来进行分析物结合。为此，从芯片中吸出校准缓冲液，并加入 50 µL 最低浓度的分析物溶液（25 nM Cdc37）。点击 继续 按钮，等待 5 分钟直至结合步骤完成。软件将显示结合步骤的终点时间（5 分钟），并发出警报提示继续操作。
- 进行分析物解离。为此，从芯片中吸出分析物溶液，并加入 50 µL 解离缓冲液（1× PBS；pH = 7.4）。点击 继续 按钮，等待 5 分钟直至解离步骤持续时间（5 分钟）结束。软件将显示解离步骤的终点时间（5 分钟），并发出警报提示后续操作。
- 接下来进行芯片再生。从芯片中吸出解离溶液，并加入 50 µL 再生缓冲液（1× PBS；pH = 7.4）。点击 继续 按钮，等待 30 秒直至再生步骤持续时间（30 秒）结束。软件将显示再生步骤的终点时间（30 秒），并发出警报提示后续操作。
- 最后，清洗芯片。从芯片中吸出再生溶液，并加入 50 µL 清洗缓冲液（1× PBS；pH = 7.4）至芯片。吸出溶液后，重复此步骤 5 次。在芯片上保留最后一次清洗液的液滴，点击 继续 按钮，等待 30 秒，直至软件界面显示清洗步骤持续时间结束。
注意：软件将显示清洗步骤的终点时间（30 秒），并发出警报提示进入实验的下一个循环。 - 对所使用的每个分析物浓度重复上述步骤；校准、分析物结合、解离、再生和清洗（5 次）五个步骤构成一个循环。本实验中，共进行 10 个循环，对应 10 个分析物浓度（浓度范围从 25 nM 到 5,000 nM 或 0.4 nM 到 200 nM；图 1）。
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结果
图1：实验方案概要。（A）芯片活化过程各步骤的概要。（B）方案中五个重复步骤的图示。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 自动化分析软件 | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA<br/> CAS number: NA | 文中所指为随仪器提供的自动化分析软件，可生成自动化分析结果。 |
| COOH-BPU（生物传感处理单元） | Agile plus software, Cardea (Nanomed) | NA<br/> CAS number: NA | 生物传感器芯片 |
| 数据审查软件 | Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) | NA<br/> CAS number: NA | 文中称为随仪器提供的数据审查软件，可用于查看和导出信息数据点。 |
| 透析袋 | CelluSep, Membrane filtration products | T2-10-15<br/> CAS number: NA | T2 型管材（6,000–8,000 MWCO），（10<br/> mm 平展宽度，6.4 mm Ø，0.32 ml/cm，15 m） |
| EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺） | Cardea (Nanomed) | EDC160322-02<br/> CAS number: 25952-53-8 | 白色粉末 |
| MES（2-(N-吗啉代)乙烷磺酸）缓冲液 | Merck | M3671-50G<br/> CAS number: 4432-31-9 | 白色粉末 |
| NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）芯片 | Cardea (Nanomed) | NA<br/> CAS number: NA | 基于石墨烯的芯片 |
| PBS（磷酸盐缓冲盐水）10 倍浓缩液 | Bio-Lab | 001623237500<br/> CAS number: 7758-11-4 | 透明液体溶液 |
| 移液器 | Thermo Scientific | 11855231<br/> CAS number: NA | Finnpipette F3 5–50 µL，黄色 |
| 封闭液 1（1 × PBS 中含 3.9 mM 氨基-PEG5-醇） | Cardea (Nanomed) | 0105-001-002-001<br/> CAS number: NA | 液体，透明溶液 |
| 封闭液 2（1 M 乙醇胺（pH = 8.5）） | Cardea (Nanomed) | 0105-001-003-001<br/> CAS number: NA | 液体，透明溶液 |
| 重组蛋白 Cdc37 | Abcam | ab256157<br/> CAS number: NA | |
| 重组蛋白 Hsp90 beta | Abcam | ab80033<br/> CAS number: NA | |
| 电子表格软件 | Excel, Microsoft office | NA<br/> CAS number: NA | |
| 统计分析软件 | GraphPad, Prism | NA<br/> CAS number: NA | 文中称为其他统计分析软件，也可使用 SigmaPlot、Python 或其他统计分析程序。 |
| Sulfo-NHS | Cardea (Nanomed) | NHS160321-07<br/> CAS number: 106627-54-7 | 白色粉末 |
| 移液器吸头 | Alex red | LC 1093-800-000<br/> CAS number: NA | 1–200 µl 吸头，散装，1,000 个 |
