基于石墨烯生物传感器的场效应生物传感检测蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

来源:Qvit， N. 等人。使用场效应生物传感技术探索分子伴侣 hsp90 与其客户蛋白激酶 cdc37 之间的生物分子相互作用。J. Vis. Exp.（2022 年）。

在本视频中，我们介绍了用于检测和量化蛋白质-蛋白质相互作用的场效应生物传感 （FEB） 技术。固定在石墨烯生物传感器上的靶蛋白与溶液中的分析物蛋白相互作用，导致 FEB 系统中的电流发生变化。电响应的这种变化表明蛋白质之间的结合亲和力。

方案

>注意:本研究中使用的重组蛋白 Hsp90 和 Cdc37 是市售的（参见材料表）。

1. 芯片激活

注意:实验中使用的所有材料都列在材料表中。通过无菌 0.2 μm 过滤器过滤所有制备的溶液。

1. 在 15 mL 试管中加入 2 mg EDC 到 2.5 mL 1 M 2-（N-吗啉代）乙烷磺酸 （MES） 缓冲液 （pH = 6.0） 中，制备 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺 （EDC） 溶液。通过在单独的 15 mL 试管中将 6 mg 磺基-NHS 添加到 2.5 mL 的 1 M MES 缓冲液 （pH = 6.0） 中来制备 N-羟基磺基琥珀酰亚胺（磺基-NHS）溶液。将每种溶液分装在独立试管中，并储存在 -20 °C 以备将来使用。
2. 通过上下移液（不要涡旋）混合等体积的 EDC 和 sulfo-NHS 溶液（50 μL EDC + 50 μL sulfo-NHS><）。 注意: EDC/sulfo-NHS 的混合溶液必须在 30 分钟内使用，以保持有效的交联以实现适当的芯片功能化。
3. 将生物传感器芯片（5.7 cm x 2.4 cm;参见材料表）放入公司提供的带有盖子的玻璃培养皿中。建议在培养皿中完成芯片激活中涉及的所有功能化步骤。将 50 μL 1 M MES 缓冲液 （pH = 6.0） 涂到生物传感器芯片上，在室温下孵育 1 分钟，然后吸出缓冲液。
4. 立即将 50 μL EDC/sulfo-NHS 溶液涂抹在传感器芯片上。盖上培养皿并在室温下孵育 15 分钟。从芯片中吸出 EDC/sulfo-NHS 溶液。
5. 用 50 μL 的 1 M MES 缓冲液 （pH = 6.0） 冲洗芯片一次;吸出 MES 缓冲液。

2. 靶蛋白固定

1. 用 50 μL 的 1x PBS （pH = 7.4） 冲洗芯片 2 次。从芯片中吸出 PBS 并添加目标分子 Hsp90 （50 μL; 500 nM><）。 注意:缓冲液不匹配可能会破坏整个实验;因此，在实验之前，重要的是要确保目标分子与用于校准的缓冲液（例如，1x PBS （pH = 7.4））相同。如果需要，在实验前通过过夜透析进行缓冲液更换。在本实验中，对重组蛋白 Hsp90 和 Cdc37 对 1x PBS（pH = 7.4;参见材料表）进行过夜透析，并在 4 °C 下进行适当的缓冲液交换。目标材料（在本例中为 Hsp90）的浓度可能因不同的实验方案和目标材料（蛋白质/肽/配体）的性质而异。
2. 盖上玻璃培养皿，在室温下孵育 30 分钟。吸出含有目标分子的溶液，并用 50 μL 的 1x PBS （pH = 7.4） 冲洗 3 次。从芯片中吸出 1x PBS （pH = 7.4） 溶液。
3. 向芯片中加入 50 μL 淬灭 1（3.9 mM 氨基-PEG5-醇，溶于 1x PBS （pH = 7.4））溶液中。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育 15 分钟。从芯片中吸出 Quench 1 溶液。
4. 向芯片中加入 50 μL 淬火 2（1 M 乙醇胺 （pH = 8.5））溶液。盖上玻璃培养皿，在室温下孵育 15 分钟。从芯片中吸出 Quench 2 溶液，并使用 50 μL 的 1x PBS 冲洗芯片 5 次，将最后一个 PBS 液滴留在传感器上。

3. 制备分析物样品

1. 在所需浓度范围内为 Cdc37 准备分析物稀释系列。对于第一个实验，使用以下浓度:25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM、800 nM、1,000 nM、2,000 nM、3,000 nM 和 5,000 nM。对于第二个实验，使用了一组不同的浓度，范围从 0.4 nM 到 200 nM。
2. 设计实验以包括至少 8 种不同的分析物浓度，以获得可靠的 KD 值。在与用于校准和目标蛋白相同的缓冲液中制备不同稀释度的分析物蛋白;这里是 1x PBS （pH = 7.4）。

4. 将激活的生物传感器芯片加载到 FEB 设备中

注意:FEB 设备由一个带有 LED 灯指示的阅读器和一个用于插入生物传感器芯片的墨盒组成。

1. 靶蛋白固定后，将活化的芯片插入设备的探针盒中，该探针盒通过 USB 连接到计算机。芯片插入后，读数仪上将显示绿色 LED 灯，表示 FEB 设备已准备好进行实验。将公司提供的自动化软件（参见材料表）安装在 FEB 设备所连接的计算机上，以如下所述逐步监控实验。

5. 运行 Experiment

1. 按下自动化软件上的"运行实验"模块，然后选择"10 点与再生"或任何其他所需的方案。填写以下详细信息:作员名称、实验名称、日期（例如，Yana、Hsp90 + Cdc37、2021 年 3 月 14 日）;再生缓冲液（例如，PBS 缓冲液）;固定目标（例如，Hsp90）;溶液中的分析物（例如 Cdc37）。
2. 按下软件上显示的 Begin the Experiment（开始实验）按钮，然后按照自动化软件显示的说明进行作，如下所述。
   注意:该软件是全自动的，用户友好的，并逐步指导用户完成整个实验过程。屏幕上将出现一个弹出窗口，其中包含在实验的每个步骤中进一步进行的说明。该软件将在整个实验过程中为每种分析物浓度的每个重复步骤提供从校准、分析物结合、解离、再生和洗涤 （5x） 的连续说明。
3. 执行仪器校准。为此，从芯片中吸出剩余的 PBS 溶液并涂抹 50 μL 校准缓冲液（1x PBS;pH = 7.4）。按下 Continue 按钮并等待 5 分钟，直到校准步骤完成。软件显示为校准步骤（5 分钟）确定的终点，并发出警告警报以进行跟进。
4. 接下来，执行分析物关联。为此，从芯片中吸出校准缓冲液，并应用 50 μL 的最低分析物浓度（25 nM Cdc37）。按 Continue 按钮并等待 5 分钟，直到关联步骤完成。软件将显示关联步骤的终端节点（5 分钟），并发出警告警报以继续。
5. 进行分析物解离。为此，从芯片中吸出分析物溶液并应用 50 μL 解离缓冲液（1x PBS;pH = 7.4）。按下 Continue 按钮并等待 5 分钟，直到解离步骤持续时间（5 分钟）结束。软件将显示解离步骤的终点（5 分钟），并发出警告警报以进行跟进。
6. 接下来，执行芯片再生。从芯片中吸出解离溶液，并应用 50 μL 再生缓冲液（1x PBS;pH = 7.4）。按下 Continue 按钮并等待 30 秒，直到再生步骤持续时间 （30 s） 结束。软件将显示重新生成步骤的终点 （30 s），并带有警告警报以进行跟进。
7. 最后，清洗芯片。从芯片中吸出再生溶液，并将 50 μL 洗涤缓冲液（1x PBS;pH = 7.4）涂在芯片上。从芯片中吸出溶液并重复 5 次。将最后一滴洗涤缓冲液留在芯片上，按下 Continue 按钮并等待 30 秒，直到软件显示屏中的洗涤步骤持续时间结束。
   注意:软件显示洗涤步骤的终点 （30 s），并带有警告警报，以继续下一个实验周期。
8. 对使用的每种分析物浓度重复这些步骤;校准、分析物结合、解离、再生和洗涤 （5x） 这五个步骤构成一个循环。对于此处显示的实验，我们对 10 种分析物浓度（范围从 25 nM 到 5,000 nM 或 0.4 nM 到 200 nM;图 1）。

结果

图 1:协议摘要。（A） 芯片激活过程的步骤摘要。（B） 协议中五个重复步骤的图形表示。

材料