利用质谱光度法在单分子水平研究抗原-抗体相互作用

摘要

来源：Wu, D. 等.，利用质量光度法快速测定抗体-抗原亲和力。视觉化实验杂志 (2021)

在本视频中，我们展示了在流动池中利用质量光度法研究抗原-抗体相互作用的方法。聚焦光根据分子质量的不同而产生差异化的散射。探测器收集散射光，并生成具有不同强度的光斑干涉图样，这些光斑强度与分子质量相对应。

方案

1. 准备流室

1. 清洗玻璃盖玻片
   1. 使用装有蒸馏水、乙醇和异丙醇的洗瓶，按以下顺序冲洗 24 mm × 50 mm 的盖玻片：水、乙醇、水、异丙醇、水。用洁净的氮气流吹干盖玻片。冲洗时应自上而下进行，用尖端柔软的镊子夹住盖玻片底部边缘。干燥时也应沿相同方向吹扫，以避免镊子污染盖玻片（图 1A）。
   2. 同样地，用蒸馏水、乙醇和蒸馏水依次冲洗 24 mm × 24 mm 的盖玻片，并用洁净的氮气流吹干。
   3. 确定盖玻片的工作面：在洁净盖玻片表面滴加一滴蒸馏水，然后按照本方案的步骤 3.1–3.2 进行操作。通常，24 mm × 50 mm 盖玻片仅有一面具备适合进行 MP 测量的光学质量。
      注意：聚焦后应无法检测到明显的表面缺陷，数据采集软件中显示的“信号”值应小于 0.05%（图 2A–C）。盒中所有盖玻片的工作面均朝向相同方向。应采用相同程序检测盖玻片清洗效果。
2. 组装流动池
   1. 将 24 mm × 24 mm 盖玻片置于一片铝箔上。如 图 1B 所示，在 24 mm × 24 mm 盖玻片上贴上双面胶条，并沿玻璃边缘裁剪胶带。将盖玻片从铝箔上取下，将其粘附在 24 mm × 50 mm 盖玻片的工作面上（图 1C）。
      注意：通道尺寸可调整，但建议宽度为 3 mm–5 mm。过宽的通道需要更大的样品体积，而过窄的通道可能难以加样。通常可在 24 mm × 24 mm 盖玻片上轻松制作两个平行通道。此处可暂停本方案。

2. 准备用于亲和力测定的抗体-抗原样品

1. 使用 0.22 µm 注射器滤器过滤至少 2 mL PBS 缓冲液，以去除灰尘颗粒或聚集体。将蛋白储备液在台式离心机中以最大速度（约 16,000 × g）离心 10 分钟。
   注意： 本方案推荐使用 PBS 缓冲液，但微尺度泳动（MP）对缓冲液无特殊要求，其他生物缓冲液也可接受。然而，高浓度甘油（>10%）和极低离子强度（盐浓度 <10 mM）可能影响图像和数据质量，不推荐使用。
2. 通过测量 280 nm 紫外吸收值，确定抗体和抗原储备液的实际浓度。
3. 计算抗原-抗体混合物的实测浓度。若抗体结合亲和力的估计值未知，建议配制含 30 nM 抗原和 20 nM 抗体浓度的样品。当已知大致亲和力时，应根据预期的 K_d 值优化抗体与抗原的比例及其浓度。在下式中，使用混合物中抗原总浓度等于预期 K_d 值与抗体总浓度之和。假设抗体两个抗原结合位点的 K_d1 = K_d2，这将使样品中游离抗体与抗体-抗原复合物的浓度相近。
   
   调整抗体浓度，使样品中总蛋白浓度保持在 10 nM 至 50 nM 范围内。使用抗体浓度在 5 nM 至 25 nM 之间的混合物可获得最佳结果。
   注意： MP 可检测分子质量大于 40 kDa 的蛋白质。因此，分子质量小于 40 kDa 的抗原样品浓度可超过典型的 50 nM 限制。然而，当浓度高于约 100 nM 时，即使是低分子质量抗原也可能影响图像质量及 K_d 测定的准确性。
4. 按照步骤 2.3 计算出的最终测定浓度，配制 50 µL 抗原-抗体混合液。
   注意： 进行 K_d 测定仅需一份抗原-抗体混合样品。但配制多份不同抗原-抗体比例的样品有助于优化样品浓度。若采集多个样品的数据，可通过全局拟合进行分析。
5. 将抗原-抗体混合液在室温下孵育约 10 分钟，使结合反应达到化学平衡。避免不必要的长时间孵育。
   注意： 孵育时间可能因结合动力学而异。为确认是否已达到化学平衡，可在不同孵育时间重复样品测量。若 K_d 值不随时间变化，则表明孵育时间足够。过长的孵育可能导致蛋白质显著吸附于塑料实验器皿表面，从而引起蛋白浓度测定的显著误差。因此，强烈建议在 MP 样品制备中使用低吸附性实验耗材。

3. 收集质量光度数据

1. 在 MP 仪器的物镜上滴加一滴显微镜浸油，并将组装好的流动室放置在显微镜载物台上。确保油完全覆盖盖玻片与物镜之间的间隙。
2. 加载流动室并聚焦质量光度计。
   1. 在第 1 步制备的流动室通道一端加入 10 µL 洁净的过滤缓冲液。液体将通过毛细作用进入通道。
   2. 调节载物台的 Z 轴位置，使显微镜聚焦于 24 × 50 mm 盖玻片的工作表面。
      1. 在数据采集软件的聚焦控制选项卡中，使用粗调载物台移动的上、下按钮进行初步调节。
      2. 点击清晰度按钮以显示清晰度信号读数，并使用精细的上、下调节按钮将清晰度值最大化。
      3. 点击设置聚焦和锁定聚焦按钮以激活聚焦跟踪功能。正确聚焦的图像（图 2A, C）其“信号”值应低于 0.05%。
         注意：如果在最大清晰度位置时“信号”值高于 0.05%，可能表明玻璃表面或缓冲液中存在杂质。
3. 使用同一通道，将 20 µL 抗体-抗原样品加在通道一端，并用一小片吸水纸从另一端吸去液体（图 1D）。
   注意：宽度为 3–5 mm 的通道体积约为 10 µL。建议使用额外样品体积以完全置换通道中的缓冲液，避免样品被稀释。
4. 加载样品后，立即点击记录按钮开始数据采集，获取一段 100 秒的视频（图 2D）。
5. 数据采集结束后，输入文件名并点击确定以保存数据文件。
6. 丢弃盖玻片，并用浸有异丙醇的棉质光学擦拭棒清洁物镜上的浸油。
   注意：本方案可在此处暂停。

4. 分析微滴式数字PCR数据

1. 使用 MP 数据处理软件处理采集的视频文件，以识别着陆事件。
   1. 使用 文件/打开 菜单选项加载待分析文件，然后点击 分析。
   2. 点击 加载 按钮以载入校准函数，并通过 文件/另存结果为 菜单选项保存分析后的数据。
2. 使用高斯函数拟合分子量分布，以获得样品中各组分的相对浓度。该分析可使用常见的科学绘图软件完成（参见 材料表）。
   1. 将“eventsFitted.csv”文件导入软件中，并使用 绘图/统计/直方图 功能绘制分子量分布（对应 .csv 文件中的 M 列）。
   2. 双击直方图以打开 绘图属性 窗口。关闭自动分组功能，并设置组距为 2.5 kDa。点击 应用 和 确定 按钮，生成 组中心 和 计数 数据。
   3. 选中 组中心 和 计数 两列，使用 分析/峰检测 和 基线/多峰拟合 菜单功能，以高斯函数对直方图进行拟合。双击以在分布图上标定各峰的大致位置，然后点击 打开NLFit 按钮。
   4. 勾选“xc”峰中心的 固定 复选框，并将其值设置为游离抗体以及单、双抗原-抗体复合物的预期分子量。对宽度参数勾选 共享 选项。点击 拟合 按钮。高斯组分的拟合峰高值代表样品中各组分的相对浓度。
      注意： 可调整组距以优化分子量分布图的分辨率。MP 的精度极限约为 1 kDa，过小的组距可能放大分布噪声，而无法提供额外信息；过大的组距则会掩盖分子量分布的细微特征。
3. 使用以下公式计算各组分的浓度分数：
   
   其中 h_i 和 f_i 分别表示样品中游离抗体以及单结合和双结合抗体的峰高和浓度分数。

结果

图1：微流控流动室的制备与加样。（A）清洗过程中盖玻片的固定位置。（B）将24 × 24 mm盖玻片（中间层）与双面胶带（顶层）在铝箔表面（底层，未显示）上对齐。蓝色虚线表示切割线位置。（C）组装完成的流动室的俯视图和侧视图，包含两个样品通道，以及组装后流动室的实际照片。（D）将样品加入预先充满缓冲液的流动通道的操作流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AcquireMP	Refeyn		MP 数据采集软件
抗人凝血酶抗体	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
棉签	Thorlabs	CTA10	用于镜头清洁的棉质光学棉签
盖玻片 24×24 mm	Globe Scientific	1405-10
盖玻片 24×50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP 数据处理软件
镊子	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	软头镊子，用于操作盖玻片
人α-凝血酶	Haematologic Technologies	HCT-0020
浸油	Thorlabs	MOIL-30
异丙醇	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		电子表格软件
OneMP	Refeyn		质量光度计仪器
Origin	OriginLab		科学绘图软件
PBS	Corning	46-013-CM	10 倍浓缩液
注射器滤器	Millipore	SLGSR33SS	缓冲液和样品过滤