利用FLIM-FRET成像表征活体细菌中的蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

来源：Manko, H. 等，活细菌中蛋白质-蛋白质相互作用的荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）测量。J. Vis. Exp. (2020)

该视频介绍了利用荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）技术，在表达带有荧光蛋白标记的胞质蛋白（供体eGFP和受体mCherry）的活细菌中检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该联合技术还可实现对相互作用蛋白的定量分析。

方案

1. 琼脂糖垫的制备（图1）

1. 将显微镜载玻片放置在平坦的水平表面上。在初始载玻片的两侧各放置一个顶部贴有两层胶带的载玻片。
   注意：保持三个对齐的载玻片之间有1-2 mm的间隙，以防止融化的琼脂糖扩散到带有胶带的载玻片上。
2. 用移液器吸取并滴加70 µL的1%融化的琼脂糖溶液到载玻片上。在其上方覆盖第四张载玻片以压平琼脂糖液滴，并轻轻按压。等待约一分钟。
3. 取下上方的载玻片，用移液器将约3 µL的细菌溶液滴加到琼脂糖垫上不同位置的3至4个点上。
4. 用显微镜盖玻片（例如22×22 mm、#1.5厚度）覆盖样品。
   注意：盖玻片的平整度和厚度对于双光子激发实验至关重要。通常选择具有受控均匀平整度和低自发荧光的高精度盖玻片较为合适。
5. 用融化的石蜡固定盖玻片，以将其密封在载玻片上。首先固定盖玻片的四个角。

2. 使用双光子显微镜系统进行成像

注意： 我们使用一台自制的双光子激发扫描倒置显微镜，配备60倍、1.2NA的水浸物镜，工作在去扫描荧光收集模式。双光子激发波长设定为930 nm，由一台Ti:Sapphire激光器提供（重复频率80 MHz，脉冲宽度≈70 fs），工作功率为10–20 mW。荧光光子依次通过680 nm短通滤光片和525/50 nm带通滤光片后，被引导至一个与时间相关单光子计数（TCSPC）模块相连的光纤耦合雪崩光电二极管进行检测。该显微镜还配备了一个透射荧光光源。目前市面上已有多种FLIM-FRET显微镜可供购买，许多成像平台也配备了能够进行FLIM-FRET测量的系统。

1. 使用荧光灯将物镜聚焦在样品中的细菌单层上，并选择感兴趣的区域。
2. 检查激发激光快门是否已关闭，并确认来自激光器的红外光被阻挡，不会进入显微镜。
   注意： 使用脉冲红外激光器时需格外小心并保持持续警惕，因为激光光束肉眼不可见，但任何直接暴露（即使是瞬时的）或激光反射都可能造成严重伤害，并导致不可逆的眼部损伤。在使用显微镜系统前，请务必参考当地激光安全规程并接受相关培训。
3. 将显微镜载玻片放置在载物台上，确保盖玻片朝向物镜。
4. 检查荧光灯是否已开启。
5. 旋转滤光片转轮，选择eGFP滤光片组，并打开荧光灯快门。
6. 将荧光光路导向显微镜的目镜。
   注意：确保在光路中正确放置滤光片，以滤除来自荧光灯的直接激发光，防止对眼睛造成损伤。
7. 使用显微镜调焦旋钮将物镜聚焦到细菌上。
8. 通过操纵控制电动载物台的操纵杆移动样品，选择感兴趣的区域。
   注： 对于荧光较强的样品，可直接通过目视观察荧光信号，使聚焦过程更加容易。
9. 切换至用于FLIM-FRET测量的2PE激光激发模式。
10. 将荧光发射光路重新导向探测器。
11. 将滤光片转轮回转，选择适用于930 nm激光的二向色镜组。
12. 将激光功率设置为20 mW。
13. 将感兴趣区域的尺寸设置为30 µm。此操作会调节驱动检流计镜的电压，从而定义其运动范围（图2）。
14. 开启探测器并开始扫描样品——控制扫描的开始和停止按钮同时控制激光快门的开启与关闭，既出于安全考虑，也可减少样品的光漂白（图2）。
15. 如有必要，可轻微调节显微镜细调焦旋钮以优化聚焦。
16. 通过计算机界面精细移动载物台来选择成像视野。可在系统上通过显微镜控制软件中的图像移动十字标记（图2），定义新的图像中心，然后点击 “Move Stage”。理想的成像视野应包含10–30个静止的细菌，且所有细菌均处于同一焦平面并清晰聚焦。若希望提取单个细菌的FLIM-FRET数据，请确保细菌彼此分离良好（便于后续图像分割）。

结果

图1. 琼脂糖垫的制备。

图2. 显微镜控制软件界面的示意图

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
525/50 nm 带通滤光片	F37-516, AHF, Germany
680 nm 短通滤光片	F37-516, AHF, Germany
琼脂糖	Sigma-Aldrich 	A9539
光纤耦合雪崩光电二极管	SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
玻璃盖玻片（1.5 号厚度，20×20 mm）	Knitel glass	MS0011
显微镜载玻片（25×75 mm）	Knitel glass	MS0057
TCSPC 模块	SPC830, Becker & Hickl, Germany
钛宝石激光器	Insight DeepSee, Spectra Physics