检测细胞黏附分子间反式相互作用的细胞聚集实验

摘要

来源：Restrepo, S.，等，在异源细胞系统中通过蛋白质聚集测量跨细胞相互作用。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了通过HEK细胞聚集实验来检测突触细胞黏附分子之间跨细胞相互作用的技术。在该实验中，将表达目标突触前细胞黏附分子和一种荧光蛋白的HEK细胞，与表达突触后细胞黏附分子及另一种荧光蛋白的HEK细胞等量混合。细胞黏附分子之间的相互作用促使细胞发生聚集，可通过荧光显微镜进行观测和测量。

方案

1. 细胞培养与转染

1. 使用添加了4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）1x，并补充10% FBS，制备HEK细胞培养基。经无菌过滤处理。
2. 预先确定适用于聚集实验的配体和受体。
   注意：本研究中使用了Neurexin3α SS4+/-及其已知配体之一LRRTM2。感兴趣的配体和受体由pcDNA3.1载体中的cDNA表达。采用Gibson组装法将Neurexin3α插入pcDNA3.1。Neurexin3α F/R：
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT。
3. 准备HEK293T细胞。
   1. 在T-75培养瓶中将HEK293T细胞培养至完全汇合。
   2. 一旦细胞汇合，加入2 mL胰蛋白酶，置于37 °C培养箱中孵育2分钟。向培养瓶中加入6 mL HEK培养基以重悬细胞，并将全部8 mL转移至15 mL圆锥形离心管中。
   3. 以500 × g离心5分钟，弃上清，用HEK细胞培养基重悬细胞，总体积为8 mL。
   4. 计数细胞，并将735,000个细胞接种至6孔板的每一孔中。使用HEK细胞培养基将每孔终体积调整为2 mL。
   5. 将细胞置于37 °C培养箱中，过夜培养，直至细胞达到50–60%汇合度。
4. 采用磷酸钙法转染HEK293T细胞。
   1. 在第1孔中转染3 µg目标蛋白，并共转染1 µg荧光蛋白（3 µg pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- 和1 µg mCherry）。
   2. 第2孔的转染方式同步骤1.4.1，但使用突变的目标蛋白（pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-）。
   3. 在第3孔中转染3 µg感兴趣的配体，并共转染1 µg另一种荧光蛋白（3 µg pcDNA3.1 LRRTM2 和1 µg GFP）。
   4. 第4孔和第5孔作为阴性对照：第4孔转染1 µg GFP，第5孔转染1 µg mCherry。
   5. 若需额外实验条件或对照（如Neurexin3α^WT/A687T SS4+），请准备另一块板（参照步骤1.4.1–1.4.4）。
      注意：转染后24小时在落射荧光显微镜下分析转染效率，并以表达相应荧光蛋白的细胞数量进行量化。更高效的方法是使用编码荧光蛋白和目标配体的双顺反子载体转染HEK细胞，该方法优于共转染，强烈推荐。但在本研究中，α-Neurexin长度约为4.3 kb，使用双顺反子系统时荧光强度较低，因此必须采用共转染。
5. 转染后48小时，收集细胞用于聚集实验。
   1. 每孔用PBS洗涤两次。
   2. 每孔加入1 mL含10 mM EDTA的PBS，轻柔解离细胞间相互作用，将培养板置于37 °C孵育5分钟。
      注意：由于胰蛋白酶可能对本研究中的黏附分子产生蛋白水解切割，因此不推荐在步骤1.5.b中使用。此外，加入EDTA后，实验流程不可中断，因为细胞将暴露于环境条件下。
   3. 轻敲培养板使细胞脱落，并将每孔细胞分别收集至独立的15 mL圆锥形离心管中。
   4. 在室温下以500 × g离心5分钟。
6. 在细胞离心过程中，准备6个孵育管，用记号笔在每个微量离心管顶部标记对应实验条件。
   注意：应使用所有GFP和mCherry条件的组合，以涵盖全部实验条件和适当的对照。例如：1. GFP/mCherry，2. mCherry/LRRTM2-GFP，3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry，4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4-—mCherry，5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP，6. Neurexin3α^A687T SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP。可根据需要增加更多试管以容纳额外条件和对照。
7. 弃去上清，用预热至37 °C的含10 mM CaCl₂和10 mM MgCl₂的HEK培养基500 µL重悬细胞。
   注意：添加CaCl₂和MgCl₂可使黏附分子重新建立结合，仅当所研究的跨细胞相互作用需要二价阳离子介导黏附时才需要此步骤。
8. 使用血细胞计数板对每个15 mL圆锥形离心管中的细胞进行计数，并将每种条件的200,000个细胞等分至步骤1.6中对应的试管中，总体积为500 µL，实现1:1混合。
   注意：每种条件的计数和分装操作应不超过5分钟。
9. 将试管置于室温下，在慢速旋转仪中孵育。

2. 图像采集

1. 针对特定样本优化显微镜采集参数。本示例中，图像在宽场显微镜上采集。使用5倍空气物镜（NA：0.15；WD：20000 μm）以获得足够大的分析视野。
2. 在步骤1.8中将两种HEK细胞条件混合后，立即评估基础聚集状态。这些图像即为“零时”图像。
   1. 将每种样本混合物各40 µL移液至带电荷的显微镜载玻片上，并在荧光下分别于488和561通道成像。
   2. 每滴样本在单一焦平面上采集三个不同的视野。
3. 在60分钟时采集最终图像，作为“60分钟时”图像。
   1. 为获得混合物经60分钟孵育后的“60分钟时”图像，从旋转管中再次取每种条件的40 µL样本，移液至带电荷的载玻片上，并按步骤2.2进行成像。
      注意：应每15分钟检查一次细胞聚集情况，直至达到饱和。聚集发生的时间取决于所测试的蛋白质。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL一次性带盖离心管	VWR	89000-028	HEK细胞混合群体的孵育
1000 mL 快速法—0.2 微米 aPES 膜流动过滤单元	赛默飞世尔科技	567-0020	HEK培养基的灭菌
15 mL SpectraTube 离心管	沃德’科学	470224-998	收获HEK细胞
6孔无菌组织培养板	VWR	100062-892	培养HEK细胞
氯化钙	Sigma	223506-500G	磷酸钙转染，HEK细胞重悬
离心机 - Sorvall Legend RT	Kendro Laboratory Products	75004377	收获HEK细胞
CO2 细胞培养箱	赛默飞世尔科技	HERACELL 150i	HEK细胞生长过程中的孵育
DMEM，1×（伊格尔培养基的达贝科改良版），含4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺 & 丙酮酸钠	康宁	10-013-CV	HEK细胞培养与维护
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 PBS (1X)	Gibco	14190-144	传代/收获HEK细胞
乙二胺四乙酸	Sigma	ED-500G	收获HEK细胞
Falcon 透气式培养瓶，75 cm² 生长面积	康宁	9381M26	培养HEK细胞
胎牛血清	Sigma	17L184	HEK细胞培养与维持
HEK293T细胞	ATCC		模型系统
ImageJ	美国国立卫生研究院	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	图像分析
六水合氯化镁	Sigma	M9272-500G	HEK细胞重悬液
无水磷酸氢二钠	Fisher BioReagents	BP332-500	磷酸钙转染
试管旋转仪			HEK细胞混合群体的孵育
UltraClear 显微镜载玻片。白色磨砂，正电荷	Denville Scientific Inc.	M1021	图像采集
宽场显微镜	蔡司	Axio Vert 200M	图像采集