检测细胞黏附分子间反式相互作用的细胞聚集实验

摘要

来源：Restrepo, S.，等，在异源细胞系统中通过蛋白质聚集测量跨细胞相互作用。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了通过HEK细胞聚集实验来检测突触细胞黏附分子之间跨细胞相互作用的技术。在该实验中，将表达目标突触前细胞黏附分子和一种荧光蛋白的HEK细胞，与表达突触后细胞黏附分子及另一种荧光蛋白的HEK细胞等量混合。细胞黏附分子之间的相互作用促使细胞发生聚集，可通过荧光显微镜进行观测和测量。

方案

1. 细胞培养与转染

1. 使用添加了4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）1x，并补充10% FBS，制备HEK细胞培养基。经无菌过滤处理。
2. 预先确定适用于聚集实验的配体和受体。
   注意：本研究中使用了Neurexin3α SS4+/-及其已知配体之一LRRTM2。感兴趣的配体和受体由pcDNA3.1载体中的cDNA表达。采用Gibson组装法将Neurexin3α插入pcDNA3.1。Neurexin3α F/R：
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT。
3. 准备HEK293T细胞。
   1. 在T-75培养瓶中将HEK293T细胞培养至完全汇合。
   2. 一旦细胞汇合，加入2 mL胰蛋白酶，置于37 °C培养箱中孵育2分钟。向培养瓶中加入6 mL HEK培养基以重悬细胞，并将全部8 mL转移至15 mL圆锥形离心管中。
   3. 以500 × g离心5分钟，弃上清，用HEK细胞培养基重悬细胞，总体积为8 mL。
   4. 计数细胞，并将735,000个细胞接种至6孔板的每一....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL一次性带盖离心管	VWR	89000-028	HEK细胞混合群体的孵育
1000 mL 快速法—0.2 微米 aPES 膜流动过滤单元	赛默飞世尔科技	567-0020	HEK培养基的灭菌
15 mL SpectraTube 离心管	沃德’科学	470224-998	收获HEK细胞
6孔无菌组织培养板	VWR	100062-892	培养HEK细胞
氯化钙	Sigma	223506-500G	磷酸钙转染，HEK细胞重悬
离心机 - Sorvall Legend RT	Kendro Laboratory Products	75004377	收获HEK细胞
CO2 细胞培养箱	赛默飞世尔科技	HERACELL 150i	HEK细胞生长过程中的孵育
DMEM，1×（伊格尔培养基的达贝科改良版），含4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺 & 丙酮酸钠	康宁	10-013-CV	HEK细胞培养与维护
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 PBS (1X)	Gibco	14190-144	传代/收获HEK细胞
乙二胺四乙酸	Sigma	ED-500G	收获HEK细胞
Falcon 透气式培养瓶，75 cm² 生长面积	康宁	9381M26	培养HEK细胞
胎牛血清	Sigma	17L184	HEK细胞培养与维持
HEK293T细胞	ATCC		模型系统
ImageJ	美国国立卫生研究院	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	图像分析
六水合氯化镁	Sigma	M9272-500G	HEK细胞重悬液
无水磷酸氢二钠	Fisher BioReagents	BP332-500	磷酸钙转染
试管旋转仪			HEK细胞混合群体的孵育
UltraClear 显微镜载玻片。白色磨砂，正电荷	Denville Scientific Inc.	M1021	图像采集
宽场显微镜	蔡司	Axio Vert 200M	图像采集