检测细胞粘附分子之间反式相互作用的细胞聚集检测

摘要

来源:Restrepo， S. 等人，通过异源细胞系统中的蛋白质聚集测量跨细胞相互作用。J. Vis. Exp. （2020 年）

在本视频中，我们演示了通过 HEK 细胞聚集测定法测量突触细胞粘附分子之间跨细胞相互作用的技术。在该测定中，将表达所需突触前细胞粘附分子和荧光蛋白的相同数量的 HEK 细胞与表达突触后细胞粘附分子和另一种荧光蛋白的 HEK 细胞混合。细胞粘附分子之间的相互作用迫使细胞聚集，这可以通过荧光显微镜测量。

方案

1. 细胞培养和转染

1. 使用DMEM，1x（Dulbecco对Eagle培养基的改良版）制作HEK细胞培养基，并补充有4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠以及10% FBS。无菌过滤器。
2. 预先确定合适的配体和受体进行聚集测定。
   注意:本研究使用了 Neurexin3α SS4 + /- 及其已知配体之一 LRRTM2。目标配体和受体由 pcDNA3.1 中的 cDNA 表达。使用 Gibson 组装将 Neurexin3α 插入 pcDNA3.1 中。Neurexin3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. 准备HEK293T细胞。
   1. 在一个 T-75 培养瓶中培养HEK293T细胞至汇合。
   2. 汇合后，使用 2 mL 胰蛋白酶并置于 37 °C 培养箱中 2 分钟。向培养瓶中加入 6 mL HEK 培养基以重悬细胞，并将所有 8 mL 转移至 15 mL 锥形管中。
   3. 以 500 x g 的离心速度沉淀 5 分钟，然后在 HEK 细胞培养基中重悬，总共 8 mL。
   4. 对细胞进行计数，并将 735,000 个细胞添加到 6 孔板的每个孔中。使用 HEK 细胞培养基将每个孔的最终体积调整为 2 mL。
   5. 置于 37 °C 培养箱中，让细胞生长过夜或直到它们达到 50-60% 汇合。
4. 使用磷酸钙方法转染 HEK293T 细胞。
   1. 用 3 μg 目标蛋白转染 well-1，并与 1 μg 荧光蛋白（3 μg pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- 和 1 μg mCherry）共转染。
   2. 如步骤 1.4.1 所示，转染 well-2。但使用感兴趣的突变蛋白 （pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-）。
   3. 用 3 μg 目标配体转染 well-3，并与 1 μg 另一种荧光蛋白（3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 和 1 μg GFP）共转染。
   4. 转染 4 孔和 5 孔作为阴性对照:4 孔用 1 μg GFP 转染，5 孔用 1 μg mCherry 转染。
   5. 如果需要额外的条件或对照（Neurexin3α^{WT / A687T} SS4 + ）.
      注意:转染后 24 小时在落射荧光显微镜下分析转染效率，并定量为表达转染荧光蛋白的细胞数。一种更简化的方法包括使用编码荧光蛋白和目标配体的双顺反子载体转染 HEK 细胞，强烈建议在共转染之前进行转染。在这项研究中，α Neurexin 为 ~4.3 kb，使用需要共转染的双顺反子系统观察到低荧光强度。
5. 转染后 48 小时，收获细胞进行聚集。
   1. 用 PBS 洗涤每个孔两次。
   2. 向每个孔中加入 1 mL 10 mM EDTA 的 PBS 溶液，以温和解离细胞间相互作用，并将板在 37 °C 下孵育 5 分钟
      注意:不建议将胰蛋白酶用于步骤 1.5.b，因为研究中粘附分子的潜在蛋白水解裂解。此外，添加 EDTA 后，该方案在完成之前不得停止，因为细胞现在将暴露在环境条件下。
   3. 轻轻敲击板以分离细胞，然后将每个孔收获到单独的 15 mL 锥形管中。
   4. 将锥形管在 500 x g 和室温下离心 5 分钟。
6. 当细胞沉淀时，通过在每种条件下标记每个微量离心管的顶部来制备 6 个孵育管><。 注意:应使用 GFP 和 mCherry 条件的每种排列来包含所有实验条件和适当的对照。例如: 1. GFP/mCherry， 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3.GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry， 4.GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry，5.Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP， 6.Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP。制作额外的试管以适应进一步的条件和控制。
7. 去除上清液，将细胞重悬于 500 μL HEK 培养基中，其中含有 10 mM CaCl₂ 和 10 mM MgCl₂，加热至 37 °C><。 注意:添加 CaCl₂ 和 MgCl₂ 可使粘附分子重新建立结合，并且仅当所讨论的跨细胞相互作用伴侣需要二价阳离子进行粘附时才需要。
8. 使用血细胞计数器对每个 15 mL 锥形管中的细胞进行计数，并从步骤 1.6 开始将每种条件的 200,000 个细胞分装到适当的试管中，以 1:1 的比例混合，总体积为 500 μL.
   注意:每个条件只需 5 分钟即可计数和分装量。
9. 在室温下在慢管旋转器中孵育试管。

2. 图像采集

1. 优化特定样品的显微镜采集参数。在本例中，图像是在宽视场显微镜上拍摄的。使用 5 倍空气物镜（NA:0.15;WD: 20000 μm） 获得足够大的视野进行分析。
2. 在步骤 1.8 中混合 HEK 细胞的两种条件后立即评估基线聚集。这些现在是"零时间"图像。
   将
   1. 40 μL 每种样品混合物移液到带电的显微镜载玻片上，并在 488 和 561 通道的荧光下成像。
   2. 每个样品滴在一个焦平面上采集三个不同的视野。
3. 在 60 分钟时获取最终图像作为"时间 60"图像。
   1. 为了在孵育 60 分钟后获得混合物的"时间 60"图像，请从旋转管中再取 40 μL 每种条件的样品，并将每个样品移液到带电的载玻片上。与步骤 2.2.
      中的图像相同 注意:应每 15 分钟检查一次细胞聚集，直到出现饱和。聚集的时间将取决于被测试的蛋白质。

材料