原位蛋白质-蛋白质相互作用研究的邻近连接实验

摘要

来源：Wang, X., 等, 利用邻近连接技术在 C. elegans 生殖系中原位检测核糖核蛋白复合物的组装 J. Vis. Exp.  (2020)

本视频介绍了用于研究线虫细胞中原位蛋白质-蛋白质相互作用的邻近连接分析技术。当目标蛋白质彼此靠近时，在连接有二抗的PLA探针的帮助下，可形成环状DNA模板。随后使用扩增溶液对探针进行扩增，产生一条长的单链DNA，再通过检测探针的杂交，实现细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的定位。

方案

注意：本实验方案使用 C. elegans 品系，其中潜在的相互作用蛋白均带有标签。强烈建议使用阴性对照品系，即其中一个带标签蛋白不与另一个带标签的候选相互作用蛋白发生相互作用。此处使用仅表达GFP的品系作为阴性对照以评估背景信号，因为在秀丽隐杆线虫中DLC-1不与GFP发生相互作用。实验组使用GFP标记的OMA-1品系，因为初步数据表明OMA-1与DLC-1可能存在相互作用。在本文中，共表达对照蛋白或检测蛋白与3xFLAG标记的DLC-1的线虫品系分别称为3xFLAG::DLC-1；GFP和3xFLAG::DLC-1；OMA-1::GFP（品系可应要求提供；更多详情见 材料表）。本实验采用3xFLAG和GFP标签，但也可使用其他标签，前提是其相应抗体与PLA试剂盒的试剂兼容。

1. 动物护理

1. 将线虫培养在接种了大肠杆菌OP50菌株的线虫生长培养基（NGM）平板上 E. coli 并在24 °C下维持培养，以实现GFP的最优表达。
2. 每2-3天传代一次成虫，以维持线虫种群并确保其营养充足。

2. 同步培养物的制备

1. 通过漂白一块喂养良好且处于生殖期的雌雄同体线虫来同步虫体发育。漂白操作步骤详见Porta-de-la-Riva等人的文献。将收集的胚胎置于含有10 mL M9最低培养基（M9缓冲液）的离心管中，在24 °C下旋转（头尾翻转）过夜孵化，以获得处于发育停滞状态的L1幼虫群体。
2. 将含有停滞L1期幼虫的离心管置于冰上孵育10分钟，然后加入冰冻的1× M9缓冲液补满离心管。
3. 使用离心机在4 °C下以600 × g 离心5分钟，使幼虫沉淀。小心吸除上清液，仅保留1–2 mL上清液。
4. 重新悬浮幼虫沉淀，用微量移液器吸取2 µL悬浮液转移至载玻片上，计数其中的幼虫数量，以确定幼虫培养液的密度，该数据将用于指导步骤2.5中的接种量。
   注意：每1 µL培养液含10–15条L1幼虫的密度适合接种。
5. 使用微量移液器转移适量的幼虫培养液，使约100–120条L1期幼虫接种于一个60 mm的OP50培养皿上。例如，若培养液密度为每1 µL含10条L1幼虫，则接种10 µL。
   注意：接种体积不应超过40 µL，否则过量液体将破坏OP50菌苔。若培养液体积超过40 µL，请重复步骤2.3–2.4，进一步浓缩以提高幼虫密度。
6. 在24 °C条件下培养线虫。记录L1幼虫接种至培养皿的时间，并定期检查其发育阶段，以确定最佳解剖时机。
   注意：在24 °C培养条件下，接种后约52小时，线虫通常发育至年轻成虫阶段，此阶段最适合进行以性腺为靶标的PLA实验。然而，不同品系及培养温度下，同步化线虫达到年轻成虫阶段的实际时间可能有所差异。

3. 解剖/性腺挤出

注意：为了使靶向性腺的 PLA 实验成功进行，必须通过解剖将性腺挤出。该方法还可释放胚胎，而胚胎也可使用本方案进行 PLA 实验（详见讨论部分）。解剖后，阴性对照样本和实验样本应同时平行进行固定和 PLA 处理。此外，建议额外准备一组样本用于荧光共免疫染色 ，以展示目标蛋白互作对的表达模式。

1. 用移液器挑取30-40条年轻成虫线虫，放入含有500 µL 1x M9缓冲液加左旋咪唑（终浓度2.5 mM）的手表玻璃皿中。收集线虫后，小心吸除并弃去大部分培养基，以去除随线虫转移的细菌。
2. 加入新鲜的500 µL 1x M9缓冲液加左旋咪唑，用移液器轻轻吹吸混匀以清洗线虫。随后小心吸除并弃去大部分液体，以清除随线虫带入的细菌。
   1. 重复此步骤2至3次，直至完全去除细菌。清洗完成后，保留约100 µL液体以保持线虫湿润。
      注意：线虫在液体中停留时间不得超过7分钟，否则会影响解剖时性腺的挤出效果。清洗过程应在解剖显微镜下进行，以便监控液体去除情况，防止线虫丢失。
3. 使用玻璃或聚乙烯移液器，将线虫转移至经0.001%多聚-L-赖氨酸包被的25 mm × 75 mm显微镜载玻片上（本实验所用载玻片四周具有环氧涂层，形成三个工作区域，每个区域为14 mm × 14 mm）。去除多余液体，使残留液体量约为10-15 µL。
4. 在解剖显微镜下，使用两根26½号细针，将一根针置于另一根之上，使针尖交叉形成剪刀状。以此方式操作，从咽部后方切断线虫，释放生殖腺。所有线虫应在5分钟内完成解剖。
   注意：有关解剖操作的更多细节可参考Gervaise和Arur此前发表的研究。
5. 完成所有线虫解剖后，轻轻将一块22 mm × 40 mm的盖玻片覆盖在载玻片上，使其与载玻片垂直，盖玻片两端应悬于载玻片之外。
6. 将载玻片置于预先冷却的铝块上（铝块置于干冰中），冷冻至少20分钟。轻轻将一支预冷的铅笔置于盖玻片上方，以防止因冰晶膨胀导致盖玻片松动。

4. 固定/封闭

1. 准备固定时，用铅笔或其他钝边工具轻弹盖玻片，使其脱落，立即将载玻片浸入盛有新鲜冰甲醇（预冷至 -20 °C）的容器中，固定 1 分钟。
2. 轻轻擦拭载玻片样品周围边缘，使后续试剂依靠表面张力保留在样品周围。在室温下加入 150 µL 固定液（2% 甲醛溶于 100 mM KH₂PO₄， pH = 7.2），孵育 5 分钟。
   注意：我们也测试了甲醇/丙酮固定程序 ，发现其与 PLA 反应兼容。
3. 将载玻片以垂直 90° 角接触纸巾，使固定液从载玻片上流下并被纸巾吸收。在 Coplin 染色缸中用 50 mL 1x PBS/1% Triton X-100/1% 牛血清白蛋白（PBT/BSA）于室温下封闭 2 次，每次 15 分钟。
   注意：建议在本步骤及第 6–9 节的洗涤步骤中使用 Coplin 染色缸或其他类型的染色缸。此类容器可提供足够体积，以实现封闭液或洗涤缓冲液与样品之间的高效交换。
4. 使用含 10% 正常山羊血清的 PBT/BSA 溶液对载玻片进行封闭。轻轻擦拭载玻片周围边缘，然后加入 100 µL 该溶液。在湿盒中室温孵育 1 小时。
   注意：此步骤强烈推荐用于 αFLAG 一抗染色。湿盒的构建方法为：用胶带将玻璃移液管固定在载玻片托盘底部，使载玻片在孵育时置于其上。在托盘中放置润湿的任务擦拭巾（材料表），以提高内部湿度，防止蒸发。在孵育过程中，用铝箔包裹盒盖和托盘，以保护样品免受光照，特别是在对光敏感的步骤中。
5. 将载玻片置于纸巾上，使 PBT/BSA/10%NGS 溶液流下，并轻轻擦拭载玻片边缘。使用封闭试剂（材料表）对载玻片进行封闭。在 14 mm × 14 mm 区域内加入一滴试剂。在湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。

5. 一抗孵育

注意：为了获得最佳的 PLA 结果并减少背景信号，可能需要优化一抗的稀释倍数（详见讨论部分）。此外，一抗应来自不同的宿主动物，以匹配 PLA 实验中所用二抗的特异性。

1. 将玻片置于纸巾上，使封闭剂流下，并轻轻擦拭边缘。使用抗体稀释液（材料表）稀释一抗。每个 14 mm × 14 mm 区域加入 40 µL 一抗溶液。
2. 将玻片置于湿盒中，于 4 °C 过夜孵育。

6. PLA 探针（二抗）孵育

注意：步骤 6-9 中，使用 A 和 B 洗涤缓冲液时需在室温下进行。如果缓冲液储存于 4 °C，则使用前应使其升至室温。

1. 在室温下，于Coplin染色缸中用50 mL的1×洗涤缓冲液A（材料表）洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤2次。将Coplin染色缸置于转速为60 rpm的轨道摇床上。
2. 将载玻片放置在纸巾上，使洗涤缓冲液自然流下，并轻轻擦拭边缘。配制40 µL含有PLUS探针和MINUS探针的溶液（用抗体稀释液按1:5比例稀释），将该溶液分别加至每个14 mm × 14 mm的区域。
3. 将载玻片置于湿盒中，在37 °C条件下孵育1小时。

7. 连接

1. 在室温下，于Coplin染色缸中用50 mL 1×洗涤缓冲液A洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤2次。将Coplin染色缸置于转速为60 rpm的轨道摇床上。
2. 用超纯水将连接缓冲液（材料表）按1:5稀释。再用该缓冲液将连接酶（材料表）按1:40稀释，以配制连接反应工作液。
   1. 将载玻片置于纸巾上，使洗涤缓冲液自然流下，并轻轻擦拭边缘。在每个14 mm × 14 mm的区域上加40 µL连接反应工作液。
3. 将载玻片置于湿盒中，在37 °C下孵育30分钟。

8. 扩增

注意：使用带有红色荧光染料的检测试剂（材料表）可在 C. elegans 组织中产生最低的背景信号。

1. 在室温下，于Coplin染色缸中用50 mL 1×洗涤缓冲液A洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤2次。将Coplin染色缸置于设定为60 rpm的轨道摇床上。
2. 用超纯水将扩增红色缓冲液（材料表）按1:5稀释。用此缓冲液将聚合酶（材料表）按1:80稀释，以配制扩增工作液，并避光保存。
   1. 将载玻片置于纸巾上，使洗涤缓冲液从载玻片上流下，并轻轻擦拭边缘。在每个14 mm × 14 mm的区域上加40 µL扩增溶液。
3. 将载玻片置于湿盒中，在37 °C下孵育1小时40分钟。确保湿盒用铝箔覆盖，以保护样品免受光照。

9. 最终洗涤

1. 在室温下，于Coplin瓶中用50 mL的1×洗涤缓冲液B（材料表）清洗载玻片2次，每次10分钟。将Coplin瓶置于转速为60 rpm的轨道摇床上。
2. 在室温下，于Coplin瓶中用50 mL的0.01×洗涤缓冲液B清洗载玻片1次，持续1分钟。将Coplin瓶置于转速为60 rpm的轨道摇床上。该缓冲液通过将洗涤缓冲液B用超纯水稀释制备而成。

10. 盖玻片封片

1. 让多余的洗涤缓冲液从玻片上流到纸巾上，并用纸巾擦去玻片环氧涂层边缘残留的缓冲液。
2. 向样本中加入 10 µL 封片介质（材料表），然后轻轻盖上盖玻片，使封片介质自然铺展。
3. 用指甲油沿盖玻片边缘涂抹，以密封盖玻片和玻片。涂抹指甲油时动作要轻柔，避免移动盖玻片而损伤生殖系组织。将玻片避光放置，使指甲油在室温下至少固化 20 分钟，之后方可置于显微镜下观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛溶液	电子显微镜服务	15710	用于配制 4% 工作液
1M KH2PO4	Sigma	P0662	配制 1M 工作储备液
1x M9	多种来源	多种	按 10x 储备液配制，使用时稀释至 1x；实验方案详见 wormbook.org
1x PBS	多种来源	多种	实验方案详见 wormbook.org
26.5 号针头	Exel International	26402	用于解剖的针头
BSA	Lampire	7500802
离心管	Thermo Scientific	05-529C	50 ml Oak Ridge 离心管，用于同步化处理
共聚焦显微镜	Zeiss	880
染色缸（Coplin Jar）	PolyLab	62101
用于冷冻样品的盖玻片	Globe Scientific	1411-10	22x40 mm，No. 1
用于封片的盖玻片	Globe Scientific	1404-15	22x22 mm，No. 1.5
免疫荧光用 DAPI 封片剂	Vector	H-1200
连接酶	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x 连接酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
扩增红缓冲液	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x 扩增红缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
连接缓冲液	Sigma-Aldrich	DUO82009	Duolink 5x 连接缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
抗体稀释液	Sigma-Aldrich	DUO82008	Duolink 抗体稀释液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供；注意：也可使用 1x PBS/1% BSA 溶液替代稀释抗体
封闭液	Sigma-Aldrich	DUO82007	Duolink 封闭液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供
PLA 封片剂	Sigma-Aldrich	DUO82040	含 DAPI 的 Duolink In Situ 封片剂
MINUS 探针	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink In Situ 探针 Anti-Mouse MINUS
PLUS 探针	Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink In Situ 探针 Anti-Rabbit PLUS
洗涤缓冲液 A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink In Situ 洗涤缓冲液 A
洗涤缓冲液 B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink In Situ 洗涤缓冲液 B
聚合酶	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink 聚合酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
落射荧光显微镜	Leica		配备 DFC300G 相机的 DM5500B 显微镜
山羊抗小鼠 Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	使用稀释比为 1:500
山羊抗兔 Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	使用稀释比为 1:200
玻璃移液管	Corning	7095B-5X
左旋咪唑（Levamisole）	ACROS Organics	187870100	配制 250 mM 工作储备液
甲醇	Fisher Scientific	A454
小鼠抗 FLAG 抗体	Sigma	F1804	免疫荧光和 PLA 实验中使用稀释比为 1:1000，建议用正常山羊血清预先封闭
指甲油	L.A. colors	CNP195
线虫生长培养基（NGM）	多种来源		实验方案详见 wormbook.org
正常山羊血清	JacksonImmuno	005-000-121
聚乙烯巴斯德移液管	Globe Scientific	135030
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P1524	以水配制成 0.1% 储备液，-20°C 保存，使用时以水 1:100 稀释后用于包被载玻片
培养皿	Tritech	PD7060	直径 60 mm
兔抗 GFP 抗体	Thermo Fisher	G10362	免疫荧光实验中使用稀释比为 1:200，PLA 实验中为 1:4000
载玻片	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	三格 14x14 mm 可高压灭菌载玻片，带条纹，通过 Fisher Scientific 定制订购；实验室内添加聚-L-赖氨酸进行包被
次氯酸钠溶液	Fisher Scientific	SS290-1
擦拭巾	Kimtech	34120	4.4x8.4 英寸擦拭巾
托盘（242x241x20 mm）	Thermo Fisher	240845	用于制作湿盒
吐温 X-100	ACROS Organics	327372500
超纯水	Milli-Q		来自 Milli-Q Integral 水纯化系统的超纯水
表面皿	Carolina Biological	742300
-20 °C 冰箱
-80 °C 冰箱
铝箔
OP50 菌株 E. coli
旋转摇床
胶带
本研究中使用的线虫品系（均可按需索取）
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP；参考文献 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); 参考文献：本研究