原位蛋白质-蛋白质相互作用研究的邻近连接实验

摘要

来源：Wang, X., 等, 利用邻近连接技术在 C. elegans 生殖系中原位检测核糖核蛋白复合物的组装 J. Vis. Exp.  (2020)

本视频介绍了用于研究线虫细胞中原位蛋白质-蛋白质相互作用的邻近连接分析技术。当目标蛋白质彼此靠近时，在连接有二抗的PLA探针的帮助下，可形成环状DNA模板。随后使用扩增溶液对探针进行扩增，产生一条长的单链DNA，再通过检测探针的杂交，实现细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的定位。

方案

注意：本实验方案使用 C. elegans 品系，其中潜在的相互作用蛋白均带有标签。强烈建议使用阴性对照品系，即其中一个带标签蛋白不与另一个带标签的候选相互作用蛋白发生相互作用。此处使用仅表达GFP的品系作为阴性对照以评估背景信号，因为在秀丽隐杆线虫中DLC-1不与GFP发生相互作用。实验组使用GFP标记的OMA-1品系，因为初步数据表明OMA-1与DLC-1可能存在相互作用。在本文中，共表达对照蛋白或检测蛋白与3xFLAG标记的DLC-1的线虫品系分别称为3xFLAG::DLC-1；GFP和3xFLAG::DLC-1；OMA-1::GFP（品系可应要求提供；更多详情见 材料表）。本实验采用3xFLAG和GFP标签，但也可使用其他标签，前提是其相应抗体与PLA试剂盒的试剂兼容。

1. 动物护理

1. 将线虫培养在接种了大肠杆菌OP50菌株的线虫生长培养基（NGM）平板上 E. coli 并在24 °C下维持培养，以实现GFP的最优表达。
2. 每2-3天传代一次成虫，以维持线虫种群并确保其营养充足。

2. 同步培养物的制备

1. 通过漂白一块喂养良好且处于生殖期的雌雄同体线虫来同步虫体发育。漂白操作步骤详见....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛溶液	电子显微镜服务	15710	用于配制 4% 工作液
1M KH2PO4	Sigma	P0662	配制 1M 工作储备液
1x M9	多种来源	多种	按 10x 储备液配制，使用时稀释至 1x；实验方案详见 wormbook.org
1x PBS	多种来源	多种	实验方案详见 wormbook.org
26.5 号针头	Exel International	26402	用于解剖的针头
BSA	Lampire	7500802
离心管	Thermo Scientific	05-529C	50 ml Oak Ridge 离心管，用于同步化处理
共聚焦显微镜	Zeiss	880
染色缸（Coplin Jar）	PolyLab	62101
用于冷冻样品的盖玻片	Globe Scientific	1411-10	22x40 mm，No. 1
用于封片的盖玻片	Globe Scientific	1404-15	22x22 mm，No. 1.5
免疫荧光用 DAPI 封片剂	Vector	H-1200
连接酶	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x 连接酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
扩增红缓冲液	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x 扩增红缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
连接缓冲液	Sigma-Aldrich	DUO82009	Duolink 5x 连接缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
抗体稀释液	Sigma-Aldrich	DUO82008	Duolink 抗体稀释液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供；注意：也可使用 1x PBS/1% BSA 溶液替代稀释抗体
封闭液	Sigma-Aldrich	DUO82007	Duolink 封闭液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供
PLA 封片剂	Sigma-Aldrich	DUO82040	含 DAPI 的 Duolink In Situ 封片剂
MINUS 探针	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink In Situ 探针 Anti-Mouse MINUS
PLUS 探针	Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink In Situ 探针 Anti-Rabbit PLUS
洗涤缓冲液 A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink In Situ 洗涤缓冲液 A
洗涤缓冲液 B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink In Situ 洗涤缓冲液 B
聚合酶	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink 聚合酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
落射荧光显微镜	Leica		配备 DFC300G 相机的 DM5500B 显微镜
山羊抗小鼠 Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	使用稀释比为 1:500
山羊抗兔 Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	使用稀释比为 1:200
玻璃移液管	Corning	7095B-5X
左旋咪唑（Levamisole）	ACROS Organics	187870100	配制 250 mM 工作储备液
甲醇	Fisher Scientific	A454
小鼠抗 FLAG 抗体	Sigma	F1804	免疫荧光和 PLA 实验中使用稀释比为 1:1000，建议用正常山羊血清预先封闭
指甲油	L.A. colors	CNP195
线虫生长培养基（NGM）	多种来源		实验方案详见 wormbook.org
正常山羊血清	JacksonImmuno	005-000-121
聚乙烯巴斯德移液管	Globe Scientific	135030
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P1524	以水配制成 0.1% 储备液，-20°C 保存，使用时以水 1:100 稀释后用于包被载玻片
培养皿	Tritech	PD7060	直径 60 mm
兔抗 GFP 抗体	Thermo Fisher	G10362	免疫荧光实验中使用稀释比为 1:200，PLA 实验中为 1:4000
载玻片	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	三格 14x14 mm 可高压灭菌载玻片，带条纹，通过 Fisher Scientific 定制订购；实验室内添加聚-L-赖氨酸进行包被
次氯酸钠溶液	Fisher Scientific	SS290-1
擦拭巾	Kimtech	34120	4.4x8.4 英寸擦拭巾
托盘（242x241x20 mm）	Thermo Fisher	240845	用于制作湿盒
吐温 X-100	ACROS Organics	327372500
超纯水	Milli-Q		来自 Milli-Q Integral 水纯化系统的超纯水
表面皿	Carolina Biological	742300
-20 °C 冰箱
-80 °C 冰箱
铝箔
OP50 菌株 E. coli
旋转摇床
胶带
本研究中使用的线虫品系（均可按需索取）
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP；参考文献 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); 参考文献：本研究