膜上蛋白质消化法用于制备共免疫沉淀蛋白质以进行相互作用研究

摘要

来源：Obama, T. 等，利用膜上消化技术评估蛋白质-蛋白质相互作用 J. Vis. Exp. （2019）

本视频展示了在PVDF膜上进行共免疫沉淀蛋白复合物以分析蛋白质-蛋白质相互作用。复合物中的还原蛋白经胰蛋白酶处理，将各个蛋白切割成较小的肽段，随后从PVDF膜中提取剩余的肽段。来自复合物中两种蛋白的捕获肽段经干燥后，重悬于低浓度甲酸溶液中，用于后续分析。

方案

1. 免疫沉淀

注意：我们采用了非十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液和柠檬酸洗脱，具体方法如下文所述。然而，也可使用实验室自建的其他免疫沉淀技术来制备LC-MS/MS样品。

1. 使用编码表位标签或融合蛋白的载体转染培养的细胞。为获得代表性数据，可使用阳离子脂质体将 J774 细胞（1 × 10⁶）转染编码绿色荧光蛋白（GFP）的载体或编码 GFP-融合 Capn6（calpain-6 基因）的载体。
2. 将抗体偶联至磁珠。
   1. 为此，取抗 GFP 抗体（2 μL/反应）与磁珠（25 μL/反应）在 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液（24.5 mM 柠檬酸，51.7 mM 磷酸氢二钠；pH 5.0）中混合于 1.5 mL 离心管中。
   2. 室温下以 50 rpm 转速旋转混合物 1 小时。随后用含 0.1% 聚氧乙烯（20）失水山梨醇单月桂酸酯的柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤 IgG 偶联磁珠三次。
3. 使用适当的裂解缓冲液裂解转染后的细胞。为获得代表性数据，可在转染后 24 小时，于 1.5 mL 离心管中在冰上用 400 µL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl；pH 7.5，120 mM NaCl，0.5% 聚氧乙烯辛基苯基醚）裂解细胞 30 分钟，裂解缓冲液中含 40 μmol/L 苯甲基磺酰氟、50 μg/mL 亮抑蛋白酶肽、50 μg/mL 抑肽酶、200 μmol/L 正钒酸钠和 1 mM 乙二醇双四乙酸（EGTA）。
4. 在 15,000 × g 条件下离心 5 分钟以澄清裂解液，并收集上清液。
5. 预清除裂解液。在 1.5 mL 离心管中加入未标记磁珠（25 μL/反应），用 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。最后一次洗涤去除缓冲液后，将细胞裂解液加至磁珠上方。室温下使用旋转仪以 50 rpm 转速旋转混合物 30 分钟。
6. 将离心管置于磁力架上 5 分钟以实现磁性分离，并收集细胞裂解液。建议使用制造商指定的磁力架。
7. 使目标蛋白与偶联磁珠结合。将免疫球蛋白 G（IgG）偶联磁珠置于磁力架上 5 分钟进行磁性分离，弃去柠檬酸缓冲液，然后将细胞裂解液加入分离后的磁珠中。
8. 室温下以 50 rpm 转速旋转混合物 1 小时。
9. 将目标蛋白与游离的非目标蛋白分离。使用含 0.1% 聚氧乙烯（20）失水山梨醇单月桂酸酯的 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。最后一次洗涤后，加入 30 µL 柠檬酸缓冲液（pH 2–3），室温孵育 5 分钟以洗脱目标蛋白。
   注意：若免疫沉淀回收率不足，可尝试使用其他表位标签（如 FLAG 或 HIS）以提高效率。若洗脱效率不足，可尝试使用其他洗脱液（如基于 SDS 的溶液）以提高效率。

2. 蛋白质的膜上消化

注意：必须使用无蛋白的材料和设备，以避免外源性蛋白质污染。此外，建议操作人员佩戴外科口罩和手套，以防止人体蛋白质污染。

1. 使用手术剪将PVDF膜裁剪成3 mm × 3 mm的小片，手术剪在使用前需用甲醇擦拭并立即干燥。
2. 在洁净的铝箔上的PVDF膜片上加入2–5 µL乙醇。
3. 在膜片完全干燥前，将洗脱液（每份2–5 µL，每个样品4–6片）加至亲水性PVDF膜上，然后空气干燥至膜表面呈哑光状。干燥后的膜可保存于4 °C。
4. 将所有膜转移至1.5 mL塑料离心管中，加入20–30 µL乙醇使膜恢复亲水性，随后用移液器吸除乙醇。
5. 在膜完全干燥前，加入200 µL含二硫苏糖醇（DTT）的反应溶液（80 mM NH₄HCO₃、10 mM DTT和20%乙腈），于56 °C孵育1小时。
6. 将反应溶液更换为300 µL碘乙酰胺溶液（80 mM NH₄HCO₃、55 mM碘乙酰胺和20%乙腈），避光于室温孵育45分钟。
7. 用1 mL蒸馏水涡旋振荡洗涤膜两次，再用1 mL 2%乙腈涡旋振荡洗涤一次，每次洗涤时间>10秒。
8. 将冻干的质谱级胰蛋白酶（材料表）直接溶解于反应溶液（含70%乙腈的30 mM NH₄HCO₃ ）中。向膜中加入含1 μg胰蛋白酶（材料表）的100 µL反应溶液（含70%乙腈的30 mM NH₄HCO₃ ），于37 °C过夜孵育。
9. 用移液器将含有胰蛋白酶消化产物的反应溶液转移至干净的1.5 mL离心管中。
10. 向膜中加入100 µL洗涤液（70%乙腈/1%三氟乙酸），于60 °C孵育2小时。收集洗涤液并与反应溶液混合。再向膜中加入100 μL洗涤液，超声处理10分钟，随后收集洗涤液并与之前的溶液混合。
11. 用实验室封口膜覆盖离心管，并用针扎几个小孔。使用真空浓缩仪将溶液干燥。
12. 将残余物溶解于10 µL 0.2%甲酸中。离心（12,000 × g，室温3分钟）后，将上清液转移至样品管中。
    注意：洗涤步骤是本部分的关键环节。在膜上蛋白质消化过程中，还原和烷基化后，必须用蒸馏水和2%乙腈对固定化蛋白质所在的膜进行洗涤，每次超过10秒，以有效去除试剂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Wako	014-00386
柠檬酸	Wako	030-05525
DTT	Nacalai tesque	14112-94
Dynabeads protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D
甲酸	Wako	066-00461
碘乙酰胺	Wako	095-02151
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000008
Living Colors A.v. 单克隆抗体 (JL-8)	Clontech	632380
NaCl	Wako	191-01665
NH4HCO3	Wako	018-21742
Nonidet P-40	Sigma	N6507	聚氧乙烯辛基苯基醚 (n=9)
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8465
测序级修饰胰蛋白酶	Promega	V5111	胰蛋白酶
正钒酸钠	Sigma	S6508
磷酸氢二钠二水合物	Sigma	71643
TFA	Wako	206-10731
Tris	Wako	207-06275
Tween-20	Wako	160-21211