生物层干涉技术检测配体与分析物之间的相互作用

摘要

来源：Desai, M.，等。利用生物层干涉技术（BLI）研究转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用。J. Vis. Exp. （2019）

在本视频中，我们演示了生物层干涉技术（BLI），用于实时检测配体与目标分析物之间的分子间相互作用。BLI通过测量白光从生物传感器表面固定化配体层反射后产生的干涉图样变化，来监测溶液中分析物与配体相互作用时所引起的变化。

方案

1. 生物传感器的水合与检测设置

1. 打开 BLItz 仪器的电源。
2. 确保仪器通过其背面的 USB 数据输出端口与计算机连接。
3. 在计算机上打开配套软件（例如 BLItz Pro），然后点击屏幕左侧的Advanced Kinetics。
4. 在软件中，根据各自的标题输入实验的所有相关信息（包括实验名称、描述、样品编号和蛋白质浓度）。
5. 点击Biosensor Type ，然后从下拉菜单中选择Ni-NTA。
   1. 在Run Settings标题下，确认摇床设置为Enable。
   2. 在Step Type List 标题下，确认列出了5个步骤：Initial Baseline、Loading、Baseline、Association 和 Dissociation。
      注意：各步骤持续时间可根据需要修改，默认建议为：Initial Baseline 和 Baseline 至少各 30 秒；Association 和 Dissociation 各 120 秒。Loading 步骤的持续时间（120 至 240 秒）取决于配体浓度及其 His-表位标签与 Ni-NTA 生物传感器之间的亲和力。
6. 从 PCR 管中取出已水化的 Ni-NTA 生物传感器，并将传感器较宽的一端滑入仪器的传感器支架上固定。
   注意：实验过程中切勿让生物传感器干燥。
7. 将一个 0.5 mL 黑色微量离心管放入仪器的管架中，并用移液器加入 400 µL 的 BLI 缓冲液。
8. 确认仪器滑块的位置使管架位于仪器黑色箭头前方。
9. 关闭仪器盖子，使生物传感器的尖端浸入微量离心管中的缓冲液中。
10. 在软件中点击Next，开始记录初始基线（Initial Baseline）。

2. 配体在生物传感器上的加载

1. 初始基线步骤记录完成后，打开仪器的盖子。
2. 将滑块向右移动，使液滴架（而非试管架）位于黑色箭头前方。
3. 用移液器吸取 4 µL 透析后的 His 标签配体，加到液滴架上，然后关闭仪器盖子。
   注意：所用配体的最佳浓度可能因不同蛋白质而异。通常浓度在 1.0 至 2.0 mg/mL 之间足以在 240 秒内使生物传感器尖端的 NTA 达到饱和。
4. 在软件中点击 下一步 以开始加载。

3. 洗去多余的配体

1. 完成加载步骤的记录后，打开仪器的盖子。
2. 将滑块向左移动，使管架再次位于黑色箭头前方。
3. 关闭仪器盖子，并确保生物传感器探头浸入管架中试管内的BLI缓冲液中。
4. 在软件中再次点击下一步，以开始记录基线。

4. 分析物与配体的结合

1. 基线步骤记录完成后，打开仪器的盖子。
2. 取下液滴架，用移液器吸除其中的蛋白质，并用双蒸水（ddH₂O）冲洗，总共冲洗5次，以清洁液滴架。
   1. 清洗后，使用擦镜纸擦拭液滴架表面。
3. 将清洁后的液滴架重新放回仪器上。
4. 将仪器上的滑块向右移动，使液滴架再次位于黑色箭头前方。
5. 用移液器将4 µL透析后的分析物加到液滴架上，然后关闭仪器盖子。
6. 在软件界面上点击 下一步，开始缔合（Association）步骤。

5. 分析物与配体的解离

1. 关联步骤记录完成后，打开仪器的盖子。
2. 将仪器上的滑块向右移动，使管架再次位于黑色箭头前方。
3. 在软件中点击 下一步，开始解离步骤。
4. 解离步骤记录完成后，打开仪器的盖子。
5. 取下液滴架和管架。
6. 用 ddH₂O 充分冲洗两者，以洗去所有蛋白。
7. 取下生物传感器并安全弃置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BLItz 仪器	ForteBio	45-5000	设备
Dip and Read Ni-NTA 生物传感器托盘	ForteBio	18-5101	用于多聚组氨酸标签蛋白的即用型 Ni-NTA 生物传感器
液滴架	ForteBio	45-5004	设备
PCR 管（0.2 mL）	Thomas Scientific	CLS6571	塑料耗材
微量离心管（黑色）	Thermo Fisher Scientific	03-391-166	塑料耗材
Kimwipes 纸巾	Thermo Fisher Scientific	06-666A	塑料耗材
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861	化学试剂
EDTA	MilliporeSigma	E6758	化学试剂
MgCl2	MilliporeSigma	M8266	化学试剂
NaCl	MilliporeSigma	S9888	化学试剂
Tris-HCl	GoldBio	T095100	缓冲液