利用荧光涨落光谱研究细胞接触处的蛋白质相互作用

摘要

来源：Dunsing, V. 等. 一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析法. 视觉化实验杂志 (2018).

本视频展示了利用荧光涨落光谱技术检测细胞间接触处细胞表面蛋白相互作用的方法。通过表达带有荧光蛋白标记的跨膜黏附受体，并混合携带两种光谱可区分荧光标记的不同细胞群体，可评估相邻细胞间不同颜色荧光标记受体之间的跨膜相互作用。 通过 荧光强度波动的互相关

方案

1. 样品制备：细胞间混合实验

注意：以下方案描述了贴壁细胞的混合操作步骤。对于悬浮培养的细胞，可据此进行相应调整。

1. 在6孔板上接种适量数量的细胞， 例如， 800,000 个 HEK 293T 细胞（使用血细胞计数板计数），在转染前一天接种。接种细胞数可根据接种至转染之间的时间间隔进行调整，并根据不同细胞类型进行相应优化。进行基础实验时（即， 目的蛋白和阴性对照），准备至少4个孔。在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞₂ 在添加了胎牛血清（10%）和L-谷氨酰胺（1%）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中
2. 根据制造商的说明转染细胞（参见 材料表).
   1. 要进行一个基础实验，需在不同的孔中分别转染目的蛋白与“绿色”荧光蛋白融合的质粒例如， 单体增强型绿色荧光蛋白（mEGFP）或黄色荧光蛋白（mEYFP）或“红色”（例如， mCherry 或 mCardinal 荧光蛋白
      注意： 在本实验方案中，我们重点关注 APLP1-mEYFP 和 APLP1-mCardinal，以及相应的阴性对照， 例如， 肉豆蔻酰化-棕榈酰化-mEYFP（myr-palm-mEYFP）和- mCardina....

结果

图1. 细胞间接触处扫描荧光互相关光谱及互相关数与亮度分析的实验流程与示意图 (A) 样品制备示意图：将两种转染了目标蛋白（例如 APLP1）的细胞群体分别与两种光谱不同的荧光蛋白（例如 mEYFP 和 mCardinal）融合，在转染后混合。在显微镜实验中选择来自不同转染细胞之间的接触区域。为避免干扰细胞外结合结构域，荧光蛋白应与目标蛋白的胞内末端融合。B扫描荧光相关光谱（sFCCS）测量在两个光谱通道（通道1，绿色；通道2，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM 培养基	PAN-Biotech	P04-01548
不含 Ca<sup>2+</sup> 和 Mg<sup>2+</sup> 的 DPBS	PAN-Biotech	P04-36500
含 Ca<sup>2+</sup> 和 Mg<sup>2+</sup> 的 DPBS	PAN-Biotech	P04-35500
胰蛋白酶 EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T 细胞	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS 酯	Thermo Fisher Scientific	A20000
罗丹明 B	Sigma-Aldrich	83689-1G
质粒 DNA	Addgene	NA	所有质粒的详细描述请参见 Dunsing 等，MBoC 2017
6 孔板	Starlab	CC7672-7506
35 mm 玻璃底培养皿	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 共聚焦显微镜	Carl Zeiss	NA
Neubauer 细胞计数板	Marienfeld	640110