免疫沉淀实验研究转染细胞中酶受体相互作用

摘要

来源：Strazza, M.，等。研究受体与酶之间功能相互作用的共免疫沉淀实验。J. Vis. Exp. (2018)。

在本视频中，我们演示了一种利用包被了抗GFP抗体的磁珠，对GFP标记的野生型和突变型PD-1蛋白进行共免疫沉淀的技术。将磁珠结合的PD-1-GFP蛋白与可与PD-1相互作用的SHP2蛋白共同孵育，从而能够鉴定PD-1中在SHP2相互作用中起关键作用的特定结构基序。

方案

1. 免疫沉淀

注意：以下步骤应在冰上或 4 °C 条件下进行。

1. 在裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.2，250 mM NaCl，0.1% NP-40，2 mM EDTA，10% 甘油）中加入蛋白酶抑制剂（将1片溶解于10 mL裂解缓冲液中）和1 mM 正钒酸钠。向细胞中加入500 µL预冷的裂解缓冲液，并立即使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下并收集。
   注意：正钒酸钠仅应添加至用于PD-1-GFP转染培养板的裂解缓冲液中，因为SHP2转染板和未转染对照板必须保留磷酸酶活性。
2. 将裂解物转移至1.5 mL预冷离心管中，在4 °C、0.005 × g条件下旋转孵育30分钟。
3. 为从裂解物中收集核后上清液（PNS），在4 °C、10,000 × g条件下离心10分钟，将上清液转移至新管中，弃去沉淀。将第二组六块培养板的上清液（图1）置于冰上保存，用于后续全细胞裂解物分析。
4. 为第一组（四块培养板）PD-1-GFP转染裂解物中的PD-1-GFP进行免疫沉淀，准备抗GFP磁珠（图1）。
   1. 为防止磁珠沉降，打开前轻轻摇动磁珠瓶。每种条件取40 µL抗GFP磁珠悬液。
   2. 在4 °C、500 × g条件下离心3分钟，弃去上清液以洗涤磁珠。
      注意：应尽量减少移液器塑料吸头与琼脂糖磁珠的接触，以防磁珠损失。建议在将磁珠转移至另一管前，剪去200 µL吸头的尖端。
   3. 将磁珠重悬于80 µL裂解缓冲液中（每样品）。
5. 将洗涤后的磁珠直接加入第一组（四块培养板）PD-1-GFP表达细胞的细胞裂解物（PNS）中（步骤1.3）。在4 °C、0.005 × g条件下旋转孵育30分钟，以免疫沉淀GFP标签蛋白。
6. 用1 mL预冷的裂解缓冲液（不含正钒酸钠）洗涤磁珠3次，每次在2,500 × g条件下离心10秒。
   注意：向磁珠中加入裂解缓冲液时，应直接将液体加在磁珠上，避免吸头接触磁珠。洗涤过程中无需反复吹打。
7. 将第一组中活性SHP2的裂解物（一块培养板；步骤1.3）均分为三份，分别加入含有洗涤后PD-1-GFP磁珠的三支离心管中（分别为野生型PD-1-GFP及两种磷酸化缺陷突变体Y223F和Y248F）。将未转染细胞裂解物体积的三分之一加入第二管野生型PD-1-GFP磁珠中，弃去剩余三分之二。
8. 在4 °C、轻柔旋转（0.005 × g）条件下孵育磁珠4小时。
9. 按照步骤1.6所述方法，用1 mL预冷裂解缓冲液（不含过钒酸盐或正钒酸钠）洗涤磁珠两次。
10. 每份样品加入80 µL裂解缓冲液（不含过钒酸盐或正钒酸钠），确保每管总体积为100 µL（20 µL磁珠和80 µL裂解缓冲液）。轻轻混匀后，将每管中的50 µL混合液转移至两个新的1.5 mL离心管中。
    注意：完成此步骤后，将得到两管含有磁珠和裂解缓冲液的混合物。其中一管将用于通过Western blot检测共免疫沉淀的SHP2。

2. SHP2 蛋白质印迹分析

1. 离心珠子并弃去上清液。
2. 向珠子中加入 20 µL 的 2x Laemmli 缓冲液（参见 材料表），在 95 °C 下煮沸 5 分钟。
3. 使用 BCA 试剂盒（参见 材料表）测定输入对照样品（第二组）的蛋白浓度。将最稀释样品中的 30 µL 转移至新离心管中。用裂解缓冲液将其余输入对照样品稀释至与最稀释样品相同的浓度，并从每份样品中取 30 µL 转移至新的离心管。
   注意：完成此步骤后，将得到 4 个管，每管含 30 µL，蛋白浓度相近，代表输入对照裂解液。
4. 向裂解液中加入等体积的 2x Laemmli 缓冲液，在 95 °C 下煮沸 5 分钟。离心珠子后，将上清液上样至 4–20% 的 Tris 基 SDS-PAGE 凝胶（参见 材料表）进行 Western 印迹分析。此外，从第二组的每份样品中各取 50 µL 上样。
5. 继续进行 Western 印迹分析。

结果

图1：实验条件与策略。 在HEK 293T细胞中表达GFP-PD-1野生型（WT）、GFP-PD-1 Y223F（ITIM突变体）或GFP-PD-1 Y248F（ITSM突变体），随后用过钒酸盐处理。通过GFP免疫沉淀收集磷酸化的GFP-PD-1蛋白，并与过表达SHP2的细胞裂解液混合，检测与各型PD-1结合的SHP2的表达水平及其活性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硝酸纤维素膜	General Electric	10600004
微量离心机	Eppendorf	5424-R	1.5 mL
BCA	Fisher	23225	双辛可宁酸检测法
抗SHP2抗体	Santa Cruz	SC-280
抗–GFP-琼脂糖	MBL	D153-8
抗GFP抗体	Roche	118144600
抗肌动蛋白抗体	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293细胞	ATCC	CRL-1573
正钒酸盐	Sigma	S6508
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836170001	无EDTA
Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液（2x）	Invitrogen	LC2676	改良Laemmli缓冲液
4-20% Tris-甘氨酸迷你胶	Invitrogen	XP04205BOX	15孔
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）酚红	Gibco	25200114
NaCl	Sigma	S7653	氯化钠