基于ELISA的诱饵蛋白与猎物蛋白相互作用分析方法

摘要

来源：Singh, B. 等，研究玻璃粘连蛋白在细菌黏附和血清抗性中作用的实验方法。J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了一种基于ELISA的技术，通过检测第二种蛋白质与固定化的第一种蛋白质的结合，来测定两种蛋白质之间的相互作用。利用酶标记的特异性抗体（如辣根过氧化物酶）检测已结合的第二种蛋白质。

方案

1. 重组PH与Vn相互作用的ELISA分析

注意： 需设置对照以排除非特异性结合。分别使用人补体因子 H（FH）和 C4b 结合蛋白（C4BP）作为阳性对照和阴性对照。

1. 将每种人源蛋白（Vn、FH 和 C4BP）分别用 Tris-HCl 缓冲液（pH 9.0，包被缓冲液）稀释至 50 nM。向每孔 Polysorp 微量滴定板中加入 100 µL 蛋白溶液。盖上板盖，4 °C 孵育过夜（16 小时），以促进蛋白在微量滴定板孔中的固定。
2. 将微量滴定板倒置于水槽上方，弃去孔内溶液，并用 PBS 每孔 300 µL 洗涤三次。用含 2.5%（w/v）BSA 的 PBS（PBS-BSA）在室温下封闭包被孔 1 小时。
3. 移除封闭液后，每孔用含 0.05%（v/v）Tween 20 的 PBS（PBST）300 µL 洗涤三次。向每个样品孔中加入 100 µL 50 nM 重组 His 标签 PH 蛋白，室温孵育 1 小时。在对照孔中仅加入 100 µL PBS-BSA。
   注意： 编码 Hif 来源 PH 的 lph 基因通过 PCR 扩增，并克隆至 pET26b 表达载体中，该载体可在表达蛋白的 C 末端添加一个 6×His 标签。将重组质粒转化至 E. coli BL21(DE3) 中进行表达。使用 Ni-NTA 树脂纯化重组蛋白。
4. 弃去孔内蛋白溶液，并用 PBST 每孔 300 µL 洗涤三次以去除未结合蛋白。每孔加入 100 µL 含辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗 His 多克隆抗体（1:10,000 稀释）的 PBS-BSA，室温孵育 1 小时。
5. 通过将四甲基联苯胺溶解于 5% 丙酮和 45% 甲醇的混合液中，配制 20 mM 溶液 A。配制溶液 B 时，将 19.2 g 柠檬酸溶于 1,000 mL H₂O 中，用 KOH 调节 pH 至 4.25，然后加入 230 µL 30% H₂O₂。将两种溶液均于室温避光保存。使用前立即取 500 µL 溶液 B 与 9.5 mL 溶液 A 混合，配制成 ELISA 检测试剂。
6. 每孔用 PBST 300 µL 洗涤三次，然后向每孔加入 100 µL ELISA 检测试剂，检测抗原-抗体复合物。
7. 每孔加入 50 µL 1 M H₂SO₄ 终止反应。使用酶标仪在 450 nm 波长下测定各孔的光密度值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AR2G 传感器	Pall Life Science	18-5095	通过氨基偶联将传感器固定蛋白质
丙酮	VWR	97064-786	分析级
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2058	适用于细胞培养
C4BP（C4b 结合蛋白）	Complement Technology, Inc.	A109	以冷冻液体形式购买
柠檬酸	Sigma-Aldrich	251275-500G	美国化学会（ACS）级
HRP 标记的抗 His 标签抗体	Abcam	ab1269	多克隆
C4BP	Complement Technology, Inc.	A109	冷冻溶液
组氨酸亲和树脂柱（HisTrap HP）	GE Health Care Life Science	17-5247-01	预装 Ni Sepharose 的柱子
带 His 标签的 PH			在本实验室中重组表达并纯化
甲醇	VWR	BDH1135-1LP	分析级
含有 C 端 6x His 标签的质粒骨架（pET26(b)）	Novagen	69862-3	DNA 载体
Polysorb 微孔板	Sigma-Aldrich	M9410	用于 ELISA
四甲基联苯胺	Sigma-Aldrich	860336-100MG	ELISA 级
人血浆来源的玻璃粘连蛋白（Vn）	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	细胞培养级