基于 ELISA 的分析诱饵和猎物蛋白之间相互作用的方法

Abstract

来源:Singh， B. et al.， 研究玻连蛋白在细菌粘附和血清耐药性中的作用的测定。J. Vis. Exp. （2018）

该视频介绍了一种基于 ELISA 的技术，该技术通过测量第二种蛋白质与固定的第一蛋白质的结合来检测两种蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用。使用用酶标记的特异性抗体（如辣根过氧化物酶）检测结合的第二种蛋白质。

Protocol

1. 重组 PH 与 Vn 之间相互作用的 ELISA 分析

注意:需要包含对照以排除非特异性结合。人因子 H （FH） 或 C4b 结合蛋白 （C4BP） 分别用作阳性和阴性对照。

1. 将每种人蛋白（Vn、FH 和 C4BP）分别在 Tris-HCl（pH 9.0）（包被缓冲液）中稀释至 50 nM。将 100 μL 蛋白质溶液分配到 Polysorp 微量滴定板的每个孔中。用盖子盖上板，并在 4 °C 下储存过夜（16 小时），以促进蛋白质固定在微量滴定板孔上。
将
2. 微量滴定板中的溶液倒置在水槽上，丢弃微量滴定板中的溶液，并用 300 μL PBS/孔清洗孔 3 次。在室温下用含有 2.5% （w/v） BSA （PBS-BSA） 的 PBS 封闭包被的孔 1 小时。
3. 去除封闭溶液后，用 300 μL PBS 洗涤孔 3 次，每孔含有 0.05% （v/v） Tween 20 （PBST）。向每个样品孔中加入 100 μL 50 nM 重组 His 标记的 PH，并在室温下孵育 1 小时。在对照孔中，仅添加 100 μL 的 PBS-BSA.
   注意:通过 PCR 扩增编码 Hif PH 的 lph 基因，并将其克隆到 pET26b 表达载体中，该载体在表达蛋白的 C 端添加 6× His 标签。将重组载体转化到

Materials