基于ELISA的诱饵蛋白与猎物蛋白相互作用分析方法

本文内容

摘要

本视频介绍了一种基于ELISA的技术，通过检测第二种蛋白质与固定化的第一种蛋白质的结合，来测定两种蛋白质之间的相互作用。利用酶标记的特异性抗体（如辣根过氧化物酶）检测已结合的第二种蛋白质。

方案

1. 重组PH与Vn相互作用的ELISA分析

注意： 需设置对照以排除非特异性结合。分别使用人补体因子 H（FH）和 C4b 结合蛋白（C4BP）作为阳性对照和阴性对照。

将每种人源蛋白（Vn、FH 和 C4BP）分别用 Tris-HCl 缓冲液（pH 9.0，包被缓冲液）稀释至 50 nM。向每孔 Polysorp 微量滴定板中加入 100 µL 蛋白溶液。盖上板盖，4 °C 孵育过夜（16 小时），以促进蛋白在微量滴定板孔中的固定。
将微量滴定板倒置于水槽上方，弃去孔内溶液，并用 PBS 每孔 300 µL 洗涤三次。用含 2.5%（w/v）BSA 的 PBS（PBS-BSA）在室温下封闭包被孔 1 小时。
移除封闭液后，每孔用含 0.05%（v/v）Tween 20 的 PBS（PBST）300 µL 洗涤三次。向每个样品孔中加入 100 µL 50 nM 重组 His 标签 PH 蛋白，室温孵育 1 小时。在对照孔中仅加入 100 µL PBS-BSA。
注意： 编码 Hif 来源 PH 的 lph 基因通过 PCR 扩增，并克隆至 pET26b 表达载体中，该载体可在表达蛋白的 C 末端添加一个 6×His 标签。将重组质粒转化至 E. coli BL21(DE3) 中进行表达。使用 N....

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