基于β-内酰胺酶的电导率生物传感器检测蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

来源：  Vandevenne, M.，等。利用基于β-内酰胺酶的电导测定生物传感器检测生物分子相互作用。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种阻抗生物传感器检测方法，用于研究抗体与固定在换能器芯片上的靶抗原之间的相互作用。该生物传感器经工程化设计，含有一种双功能嵌合蛋白——即一个具有功能性催化位点的β-内酰胺酶，与一个可结合固定化靶抗原的纳米抗体相融合。当发生结合后，β-内酰胺酶对抗生素底物的催化水解反应产生电信号，从而确认抗原-抗体的相互作用。

方案

1. 蛋白质样品制备

1. 按照我们之前的研究方法制备并纯化杂合蛋白BlaP-cAb-Lys3。将蛋白储存于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，缓冲液组成为：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄  和0.24 g KH₂PO₄ 溶解于800 mL蒸馏水中，在定容至1 L前将溶液pH调至7.4。用滤膜过滤除菌处理蛋白溶液。
2. 配制溶菌酶（HEWL）储备液。将100 mg（40,000 单位/mg）市售的鸡蛋清溶菌酶（HEWL）溶解于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS，见步骤2.1.1）中。使用孔径0.22 μm的滤膜过滤除菌处理蛋白溶液。

2. 生物传感器检测

1. 溶液与缓冲液的配制
   1. 通过将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶于 800 mL 去离子水中，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加去离子水定容至 1 L，来配制 50 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）。₂HPO₄，以及 0.24 g KH₂PO₄ 在800 mL蒸馏水中溶解。在将溶液定容至1 L前，用1 N HCl....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Tris–HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
丙氨酸	Sigma-Aldrich	A7627
HClO4	Fluka	34288	1 M HClO4 溶液，分销商：Sigma-Aldrich
酪蛋白水解物	Sigma-Aldrich	22090
青霉素钠	Sigma-Aldrich	B0900000
鸡蛋清溶菌酶	Roche	10837059001
庚烷	Sigma-Aldrich	246654
甲醇	Sigma-Aldrich	322415
氨水溶液	Sigma-Aldrich	380539	28% NH3 的 H2O 溶液，经双重蒸馏纯化（浓？）
实验室耗材
6孔板	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-孔板
设备
pH计	WTW	1AA110	Lab pH计 inoLab pH 7110
真空过滤系统	Nalgene	NALG300-4100	带接收瓶的滤器，分销商：VWR
电位传感器芯片			由Yunus及其同事制造（参考文献16）
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		已停产，后继型号为Autolab PGSTAT302N
数字万用表，METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		已停产，后继型号为Metrahit Base