基于β-内酰胺酶的电导率生物传感器检测蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

来源：  Vandevenne, M.，等。利用基于β-内酰胺酶的电导测定生物传感器检测生物分子相互作用。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种阻抗生物传感器检测方法，用于研究抗体与固定在换能器芯片上的靶抗原之间的相互作用。该生物传感器经工程化设计，含有一种双功能嵌合蛋白——即一个具有功能性催化位点的β-内酰胺酶，与一个可结合固定化靶抗原的纳米抗体相融合。当发生结合后，β-内酰胺酶对抗生素底物的催化水解反应产生电信号，从而确认抗原-抗体的相互作用。

方案

1. 蛋白质样品制备

1. 按照我们之前的研究方法制备并纯化杂合蛋白BlaP-cAb-Lys3。将蛋白储存于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，缓冲液组成为：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄  和0.24 g KH₂PO₄ 溶解于800 mL蒸馏水中，在定容至1 L前将溶液pH调至7.4。用滤膜过滤除菌处理蛋白溶液。
2. 配制溶菌酶（HEWL）储备液。将100 mg（40,000 单位/mg）市售的鸡蛋清溶菌酶（HEWL）溶解于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS，见步骤2.1.1）中。使用孔径0.22 μm的滤膜过滤除菌处理蛋白溶液。

2. 生物传感器检测

1. 溶液与缓冲液的配制
   1. 通过将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶于 800 mL 去离子水中，用 HCl 调节 pH 至 7.4，加去离子水定容至 1 L，来配制 50 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）。₂HPO₄，以及 0.24 g KH₂PO₄ 在800 mL蒸馏水中溶解。在将溶液定容至1 L前，用1 N HCl或1 N NaOH调节pH至7.4。过滤除菌后，4 °C保存。
   2. 将3 g酪蛋白水解物溶解于100 mL上述步骤（见步骤2.1.1）制备的PBS中，配制饱和/封闭溶液。过滤除菌后，4 °C保存。
   3. 将1 g酪蛋白水解物溶解于100 mL上述步骤（见步骤2.1.1）制备的PBS中，配制结合溶液。过滤除菌后，4 °C保存。
   4. 将100 μL吐温20（100%）加入100 mL上述步骤（见步骤2.1.1）制备的PBS中，配制洗涤液（0.1%吐温-PBS）。4 °C保存。
   5. 配制电极制备液（1% Triton X-100 - PBS），即按上述方法（见步骤2.1.1）配制的PBS 100 mL中加入1 mL Triton X-100（100%），混匀后于4 °C保存。
   6. 配制电极再生溶液（3.5 M KCl），即将26 g KCl溶于蒸馏水中，定容至100 mL。过滤除菌后于4 °C保存。
   7. 将0.29 g NaCl溶于蒸馏水中，定容至1 L，配制5 mM NaCl溶液。过滤除菌后于4 °C保存。随后，将26.7 mg苄青霉素溶于20 mL 5 mM NaCl溶液中，配制检测溶液（4 mM苄青霉素）。过滤除菌后于-20 °C保存。
2. 传感器的制备与再生
   注意： 聚苯胺涂层传感器芯片由比利时鲁汶-拉-讷夫天主教大学（Catholic University of Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne）的P. Bogaerts博士、S. Yunus博士和Y. Glupczynski教授开发并慷慨提供。该传感器的结构描述以及用于合成这些传感器的聚苯胺电聚合方法详见于他们的前期研究工作中。简而言之，该系统采用可重复使用的传感器，每个传感器包含八个独立的芯片，芯片通过传统的印刷电路板（PCB）技术制造而成。每个独立芯片由三个圆形电极区域组成：最上方为工作电极，聚苯胺在此电极上通过电化学合成；中间为参比电极；最下方为对电极。参比电极和对电极均在碳层表面修饰了固态Ag/AgCl汞齐材料。
   1. 将电极尖端浸入含有300 µL/孔电极预处理液（1% Triton X-100 - PBS，见步骤2.1.5）的96孔板孔中，进行3次洗涤。每次洗涤在室温下轻轻混匀2分钟。
   2. 将电极尖端浸入含有300 µL/孔蒸馏水的96孔板的孔中，室温下轻轻混匀2分钟，以清洗电极。
   3. 通过将电极尖端浸入含有300 µL/孔再生液（3.5 M KCl，参见步骤2.1.6）的96孔板孔中，在4 °C下过夜或室温下1小时，以再生电极。
   4. 将电极尖端浸入含有300 µL/孔磷酸盐缓冲液的96孔板孔中，进行3次洗涤（参见步骤2.1.1）。每次洗涤在室温下轻轻混匀2分钟。
3. 在传感器上进行的结合实验
   1. 将15 µL用PBS配制的40 µg/mL HEWL溶液滴加到电极的PANI（聚苯胺）表面，使HEWL包被电极表面。4 °C过夜孵育，或室温孵育1小时。
   2. 将传感器芯片的电极部分浸入含有300 µL/孔磷酸盐缓冲液的96孔板孔中，用磷酸盐缓冲液（见步骤2.1.1）清洗电极3次。每次清洗在室温下轻柔混匀2分钟。
   3. 在电极表面滴加50 µL封闭液（见步骤2.1.2），使电极充分饱和。室温孵育1小时。随后按前一步骤所述方法洗涤三次（见步骤2.3.2）。
   4. 将BlaP-cAb-Lys3溶液用结合缓冲液（见步骤2.1.3）稀释至20 µg/mL，取15 µL稀释后的溶液滴加到电极上，室温孵育10分钟。抗原与纳米抗体反应后，使用洗涤缓冲液（见步骤2.1.4）按前述步骤洗涤三次，随后用PBS冲洗电极一次（见步骤2.1.1）。
   5. 用于检测时，将传感器芯片的铜电路部分插入数字万用表。随后，在正极电极上施加50 µL检测溶液（见步骤2.1.7），在负极电极上施加50 µL 5 mM NaCl溶液（见步骤2.1.7），以启动传感器响应。室温孵育30分钟，使用数字万用表监测电导变化。
      注意： 该万用表由P. Bogaerts博士、S. Yunus博士和Y. Glupczynski教授（比利时新鲁汶天主教大学－蒙戈迪讷大学医院）提供。该恒电位仪由计算机控制。 通过 一个USB端口，并同时分析传感器的八个不同芯片。Yunus及其同事开发的软件可生成实时曲线图，显示参考电极与样品电极之间的电导差随时间变化的测量结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Tris–HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
丙氨酸	Sigma-Aldrich	A7627
HClO4	Fluka	34288	1 M HClO4 溶液，分销商：Sigma-Aldrich
酪蛋白水解物	Sigma-Aldrich	22090
青霉素钠	Sigma-Aldrich	B0900000
鸡蛋清溶菌酶	Roche	10837059001
庚烷	Sigma-Aldrich	246654
甲醇	Sigma-Aldrich	322415
氨水溶液	Sigma-Aldrich	380539	28% NH3 的 H2O 溶液，经双重蒸馏纯化（浓？）
实验室耗材
6孔板	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-孔板
设备
pH计	WTW	1AA110	Lab pH计 inoLab pH 7110
真空过滤系统	Nalgene	NALG300-4100	带接收瓶的滤器，分销商：VWR
电位传感器芯片			由Yunus及其同事制造（参考文献16）
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		已停产，后继型号为Autolab PGSTAT302N
数字万用表，METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		已停产，后继型号为Metrahit Base