生物素标记的细胞穿透肽探针用于检测蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

来源：Jaraíz-Rodríguez, M. 等，利用生物素标记的细胞穿透肽研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种利用生物素标记的细胞穿透肽检测细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的技术。细胞穿透肽可促进其偶联的肽段进入细胞，并特异性结合与其相互作用的蛋白质。在与亲和素结合后，生物素能够从细胞裂解液中纯化出相互作用蛋白质的复合物。

方案

1. 细胞

1. 在开始实验前两天，以所需密度接种细胞，使其在实验当天达到汇合状态。可将细胞接种于培养瓶或培养板中，但从培养板中提取蛋白更为方便。为确保结果的一致性，建议每个实验条件至少准备4个78 cm²的培养板或2个150 cm²的培养瓶。
2. 本研究中，将人源G166 GSCs细胞接种于4个150 cm²的培养瓶中，使用RHB-A干细胞培养基培养，培养基中添加2% B27、1% N2、20 ng/mL EGF和b-FGF，具体方法参照Pollard et al. 的描述。当细胞达到汇合状态时进行处理。例如，将5 × 10⁶个G166细胞接种至150 cm²培养瓶后，于接种后第2天进行处理。

2. 生物素标记的 CPPs

1. 将含有冻干的生物素化细胞穿透肽（BCPPs）的离心管在8200 × g 条件下离心30秒，以避免部分粉末残留在管盖上。实验中应包含对照用BCPP，以确保所检测到的相互作用是特异性针对目标序列的。本研究中，对照BCPP为TATbiotin（TAT-B），处理组BCPP为TAT-Cx43_266-283-B。也可使用其他对照，例如与生物素连接的TAT融合至随机序列或突变片段。
2. 将BCPPs溶解于制造商指定的相应培养基中，配制成储备液；例如，为获得2 mg/mL的BCPP储备液用于处理GSCs，可向含有1 mg BCPP的离心管中加入0.5 mL GSC培养基。涡旋混匀，并确保肽充分溶解。

3. 试管

注意：每个条件至少准备十二个1.5 mL离心管，具体条件见第 节

1. 为每种条件标记前3个试管。这些试管将装有步骤6.4中获得的细胞裂解液总体积。
2. 为每种条件的3个试管标记“A”。这些试管将装有细胞裂解液裂解并离心后获得的第一次上清液（步骤7.2）。
3. 为每种条件的3个试管标记“B”。这些试管将装有第一次上清液的一小部分等分试样。这些裂解液将作为步骤7.3中的Western印迹样品。
4. 为每种条件的3个试管标记“C”。这些试管将装有使用NeutrAvidin进行下拉反应后获得的上清液（步骤7.7）。
   注意：这一步非常重要，以防Western印迹未检测到目标蛋白信号，表明蛋白可能未被成功下拉或在实验流程的某个步骤中丢失。若出现此情况，应重复蛋白下拉过程。

4. 使用 BCPPs 进行细胞处理

1. 吸除培养基。
2. 根据孵育时间，用所需的新鲜培养基替换相应体积，以尽可能小的培养基体积孵育BCPPs。必须确保培养基完全覆盖培养板/培养瓶的整个表面，防止细胞干燥，例如每150 cm²使用6 mL。² 孵育30分钟。
3. 将BCPP储备液的体积加入细胞培养物中，以达到已被证实有效的浓度。在本研究中，50 µM TAT-Cx43266-283-B 已被证实可减少GSC增殖。
   1. 因此，加入92.8 µL的2 mg/mL TAT-Cx43_266-283每毫升培养基中加入分子量为3723.34 g/mol的B，以获得50 µM的TAT-Cx43终浓度_266-283- B. 若对照肽的添加体积不同，需用培养基补足至相同的最终体积。例如，每毫升培养基中加入 49.1 µL TAT-B（MW = 1914.31 g/mol）和 43.7 µL GSC 培养基，以达到 50 µM 的 TAT-B 最终浓度。
4. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中₂ 孵育30分钟，以确保BCPP与其细胞内相互作用伙伴之间的相互作用发生。如果相互作用需要更长时间，则应延长孵育时间，或在实验设计为时间进程实验时相应调整孵育时间。此外，可通过激活不同的细胞内信号通路来促进或抑制目标相互作用。

5. 缓冲液与溶液

1. 配制 PBS（pH 7.4）：136 mM NaCl；2.7 mM KCl；7.8 mM Na₂HPO₄·2H₂O；1.7 mM KH₂PO₄。
2. 配制蛋白裂解缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 8.0），137 mM NaCl，1% IGEPAL。使用前加入以下成分：蛋白酶抑制剂混合物（v/v）1/100、1 mM 氟化钠、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 0.1 mM 原钒酸钠。
3. 配制 Laemmli 缓冲液（4×）：0.18 M Tris-HCl（pH 6.8）；5 M 甘油；3.7% SDS（p/v）；0.6 M β-巯基乙醇或 9 mM DTT；0.04%（v/v）溴酚蓝（BB）。

6. 蛋白质提取

注意：蛋白质提取按先前所述方法进行。本操作步骤的整个部分均需在 4 °C 下进行。

1. 完全吸除培养基。
2. 每 150 cm² 面积用 3 次各 10 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）小心清洗，避免细胞脱落。
3. 为获得细胞裂解液，每 150 cm² 加入 3 mL 裂解缓冲液，用细胞刮充分刮取培养表面。将培养皿或培养瓶倾斜约 45 度，有助于将细胞裂解液收集至相应的离心管中。
4. 将 1 mL 细胞裂解液分装至三个 1.5 mL 离心管中。这些离心管应按照步骤 3.1 的指示标记相应的实验条件和重复编号。

7. 下拉实验

1. 将1.5 mL离心管在11,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。
2. 将上清液转移至新管中（A）。
3. 按不同条件分别取此上清液等分试样至不同离心管（B）中，每管50 µL。每50 µL裂解液加入4x Laemmli缓冲液16.6 µL，混匀后于-20 °C冻存。这些裂解液将作为常规Western blot样品使用。
4. 充分混匀 NeutrAvidin Agarose，可通过轻柔振荡实现。剪去移液枪头的尖端以增大其直径，从而改善对珠子的移液操作。在 (A) 管中，每毫升细胞裂解液加入 50 µL NeutrAvidin Agarose。
5. 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜，使 NeutrAvidin 与结合其细胞内互作伙伴的 BCPPs 相互作用。
6. 3,000 × g 离心 g 在 4 °C 下离心 1 分钟，以收集 NeutrAvidin 与蛋白质的复合物。
7. 小心移去上清液，并转移至洁净的离心管中（C），保留以备下拉实验未成功时使用。
8. 洗涤步骤：向沉淀物（A管）中加入新鲜裂解缓冲液，通过倒置混匀，重复步骤7.6和7.7共五次。所有这些上清液均可弃去。
9. 移去上清液，向所需终体积加入2倍浓度的Laemmli缓冲液（每1.5 mL离心管获得的沉淀物加40 µL）² 汇合细胞的培养瓶。
10. 在100 °C下洗脱5分钟以解离蛋白质之间的相互作用，并在8,200 x g下离心30秒 g 离心收集 NeutrAvidin 珠。
11. 吸取上清液（含有解离的蛋白质）至新管中（D），使用毛细管吸头。若需重复洗脱步骤，可保留珠子。
    注意： 上清液（D管）现已准备好用于Western blot上样，或可在-20 °C冷冻保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
G166 GSC 细胞系	生物重复
RHB-A 干细胞培养基	宝生物工程（Takara）	Y40001
小鼠层粘连蛋白（Laminin Mouse Protein）	英潍捷基（Invitrogen）、生命技术公司（Life Technologies）、赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific）	23017-015	10 µg/ml
B-27 无血清添加剂（50X）	英潍捷基（Invitrogen）、生命技术公司（Life Technologies）、赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific）	17504-044	2%
N-2 添加剂（100x）	英潍捷基（Invitrogen）、生命技术公司（Life Technologies）、赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific）	17502-048	1%
重组人 EGF	Peprotech	AF-100-15	20 ng/ml
重组人 b-FGF	Peprotech	AF-100-18B	20 ng/ml
PBS pH 7.4：去离子水中含 136 mM NaCl；2.7 mM KCl；7.8 mM Na2HPO4·2H2O；1.7 mM KH2PO4
TAT	金斯瑞（GenScript）		定制合成
TAT-B	金斯瑞（GenScript）		定制合成
TAT-Cx43266-283	金斯瑞（GenScript）		定制合成
TAT-Cx43266-283-B	金斯瑞（GenScript）		定制合成
Pierce™ NeutrAvidin™ 琼脂糖	赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific）	29200
蛋白裂解缓冲液：5 mM Tris HCl (pH 6.8)，2% (w/v) SDS，2 mM EDTA，2 mM EGTA
氟化钠	PanReac AppliChem	141675	1 mM
苯甲基磺酰氟（PMSF）	西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich）	P7626	1 mM
正钒酸钠	西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich）	S6508	0.1 mM
Laemmli 缓冲液（4x）：0.18 M Tris-HCl pH 6.8；5 M 甘油；3.7 % (w/v) SDS；0.6 M β-巯基乙醇或 9 mM DTT；0.04% (v/v) 溴酚蓝（BB）