酵母双杂交实验检测酵母细胞中蛋白质的自身结合能力

摘要

来源：Stanczyk, P. J., 等，体内与体外评估蛋白质寡聚化的遗传学与生物化学方法：以兰尼碱受体为例的研究。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了利用酵母双杂交实验检测特定蛋白质自身相互作用的方法。在该实验中，将目标蛋白分别与编码β-半乳糖苷酶的转录因子的两个结构域进行融合标记。当两个蛋白发生相互作用时，会启动转录和翻译过程，形成具有活性的酶，随后通过生化实验检测该酶的存在。

方案

1. 酵母转化

1. 在室温下，将酵母以1,500 ×g离心5分钟（使用50 ml离心管），弃去上清液，将每个沉淀重悬于5 ml无菌H₂O中，并合并。
2. 在室温下以1,500 × g再次离心5分钟，弃去上清液。将酵母沉淀重悬于1 ml新鲜配制的无菌1× LiAc/TE溶液中。
   注意：制备后1小时内使用感受态酵母细胞。
3. 在1.5 ml离心管中准备质粒样品：单转化时加入200 ng质粒DNA，共转化时每种质粒DNA加入0.5–1 µg，并加入100 µg鲱鱼精子载体DNA（使用前煮沸20分钟，冰上冷却）。
    注意：应设置阳性对照，例如，用pVA3（编码GAL4 DNA结合域与p53蛋白的融合蛋白）和pTD1（编码GAL4激活域与SV40大T抗原的融合蛋白）共转化酵母。
4. 加入100 µl新鲜制备的感受态酵母悬液和600 µl 1× LiAc/PEG溶液（含8 ml PEG 3350储存液、1 ml TE储存液、1 ml LiAc储存液），涡旋混匀约30秒。在30 °C、200 rpm振荡条件下孵育30分钟。
5. 加入80 µl二甲基亚砜（终浓度为10% v/v），轻轻颠倒混匀。在42 °C水浴中热激15分钟，每2–3分钟混匀一次。
6. 将细胞悬液在冰上冷却2分钟，然后在室温下以14,000 × g离心15秒，回收酵母细胞。
7. 将细胞沉淀重悬于100 µl 1× TE中，涂布于适当的最小SD选择培养基平板上进行选择性培养（培养基中缺乏亮氨酸和色氨酸，以维持对诱饵和靶质粒的选择压力）。
8. 将平板倒置于30 °C培养，直至菌落直径达约2 mm（通常为4–5天）。平板可在4 °C保存2–3周；长期保存可制备甘油菌种并储存于-80 °C。
   注意：应通过免疫印迹验证诱饵蛋白和靶蛋白在酵母中的表达，并确认它们在单独表达时不会自主激活报告基因。
9. 加入100 µl新鲜制备的感受态酵母悬液和600 µl 1× LiAc/PEG溶液（含8 ml PEG 3350储存液、1 ml TE储存液、1 ml LiAc储存液），涡旋混匀约30秒。在30 °C、200 rpm振荡条件下孵育30分钟。
10. 加入80 µl二甲基亚砜（终浓度为10% v/v），轻轻颠倒混匀。在42 °C水浴中热激15分钟，每2–3分钟混匀一次。
11. 将细胞悬液在冰上冷却2分钟，然后在室温下以14,000 ×g离心15秒，回收酵母细胞。
12. 将细胞沉淀重悬于100 µl 1× TE中，涂布于适当的最小SD选择培养基平板上进行选择性培养（培养基中缺乏亮氨酸和色氨酸，以维持对诱饵和靶质粒的选择压力）。
13. 将平板倒置于30 °C培养，直至菌落直径达约2 mm（通常为4–5天）。平板可在4 °C保存2–3周；长期保存可制备甘油菌种并储存于-80 °C。
    注意：应通过免疫印迹验证诱饵蛋白和靶蛋白在酵母中的表达，并确认它们在单独表达时不会自主激活报告基因。

2. 菌落印迹滤纸β-半乳糖苷酶检测

1. 准备以下缓冲液：
   1. 配制含有 100 mM Na₂HPO₄、40 mM NaH₂PO₄、10 mM KCl 和 1 mM MgSO₄ 的 Z 缓冲液；调节 pH 至 7.4。经高压灭菌后，室温保存。
   2. 将 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-Gal）以 20 mg/ml 的浓度溶于 N,N-二甲基甲酰胺中，配制 X-Gal 储存液，并避光保存于 -20 °C。使用前将 X-Gal 稀释至 0.33 mg/ml，β-巯基乙醇稀释至 0.27%（v/v），加入 Z 缓冲液中，配成 Z 缓冲液/X-Gal 工作液。每份样品使用 2.5 ml。
2. 将 2.5 ml 新鲜配制的 Z 缓冲液/X-Gal 工作液加入洁净的 100 mm 培养皿中，并将一张纤维素滤纸浸入其中。
3. 将一张新的滤纸覆盖在待检测酵母菌落的平板表面，用镊子轻轻按压滤纸，使菌落转移至滤纸上，静置约 5 分钟，确保菌落充分附着。
   注意：同时平行处理阳性对照，即共转化 pVA3 和 pTD1 质粒的酵母菌株。
4. 用镊子将滤纸取出，迅速浸入液氮中冷冻 30 秒（操作液氮时需格外小心，务必佩戴厚手套和护目镜）。随后将冷冻的滤纸置于室温下解冻约 2 分钟。
5. 将滤纸（菌落面朝上）放置于已浸透工作液的滤纸上方，放入 100 mm 培养皿中，于 30 °C 恒温培养。
6. 定期（约每 30 分钟）观察蓝色菌落的出现情况。
   注意：弱相互作用的诱饵-靶蛋白组合可能需要数小时才能产生明显的蓝色信号（应避免长时间孵育（>8 小时），以防出现假阳性结果）。为获得最佳结果，建议使用新鲜共转化的菌落，即在 30 °C 培养 4–5 天、直径约 2 mm 的菌落。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养板孵育器	Hereaus	B6120	设备
轨道摇床培养箱	New Brunswick Scientific	INNOVA 4300	设备
分光光度计	Perkin Elmer	Lambda Bio+	设备
Matchmaker 双杂交系统 2 试剂盒	Takara Clontech	K1604-1	包含诱饵载体 pGBKT7、猎物载体 pACT2 和酵母菌株 Y190
酵母氮碱基	Sigma-Aldrich	Y0626	用于配制基本 SD 培养基
缺乏亮氨酸和色氨酸的缺失补充剂	Sigma-Aldrich	Y0750	用于配制基本 SD 培养基
缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的缺失补充剂	Sigma-Aldrich	Y2001	用于配制基本 SD 培养基
鲱鱼精子载体 DNA	Takara Clontech	630440	用于酵母转化
Whatman 5 号滤纸	Sigma-Aldrich	WHA1005070	用于菌落印迹滤纸 β-半乳糖苷酶检测
X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷）	Sigma-Aldrich	B4252	用于菌落印迹滤纸 β-半乳糖苷酶检测