串联亲和纯化实验用于研究蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

来源：Ma, Z., 等. 从真核细胞中串联亲和纯化蛋白质复合物. J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了串联亲和纯化技术——一种用于从真核细胞中纯化蛋白质复合物以研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该复合物包含两种带有不同表位标签的蛋白质。通过依次使用两种对不同标签具有亲和力的树脂纯化该复合物后，若在洗脱液中同时检测到这两种蛋白质，则可证实二者之间存在相互作用。

方案

1. 细胞铺板

1. 转染前一天，将 3.5 × 10⁶ 个 HEK293T 细胞接种于每 100 mm 培养皿中，每皿加入 10 mL 添加了 10%（v/v）胎牛血清（FBS）和 1%（v/v）青霉素/链霉素（10,000 U/mL 储液）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。每个实验/条件接种 3–5 个 100 mm² 培养皿，以确保获得足够的蛋白量。
   注意：所需培养皿数量需根据每个实验/条件的具体情况确定，取决于目标蛋白复合物的表达水平和溶解度。或者，若需要更大规模的纯化，可将细胞系适应于在旋转培养瓶中的悬浮培养生长，但该方法不适用于瞬时转染。

2. 转染细胞或诱导稳定细胞系

1. 次日，在显微镜下观察细胞。在继续操作前，细胞融合度必须达到 70 - 80%。
2. 每 100 mm 培养皿中，使用含有 7 µg 质粒 DNA 和 21 µl 转染试剂的总混合物对细胞进行转染。使用表达 GFP 的载体（表 1）作为转染效率的对照。
   注意：若使用 HEK293-T-REx 或类似的稳定细胞系，该细胞系可在多西环素诱导下表达两个或多个复合亚基，则需向细胞中加入诱导剂并孵育 48 小时。同样，为验证目的，也需要使用在加入诱导剂后可诱导表达 GFP 的稳定细胞系。继续进行步骤 2.7。
3. 为每 100 mm 培养皿配制转染混合液。取一个 1.5 ml 微量离心管，将 500 µl 未添加补充物的 DMEM 与 7 µg 总质粒 DNA（对应两个或多个质粒）混合。另取一个微量离心管，将 500 µl 未添加补充物的 DMEM 与 21 µl 转染试剂混合。每个转染反应均需重复此步骤。
4. 将转染试剂溶液加入质粒 DNA 溶液中（切勿以相反顺序混合）。通过移液至少吹打混合 4 次。
5. 室温孵育该混合物 10 - 15 分钟，但不得超过 15 分钟。
6. 倾斜培养皿以形成一个液体储区，小心地将转染混合液逐滴加至培养皿内壁，避免扰动细胞。将培养皿恢复至水平位置，轻轻摇晃以均匀分布混合液。
7. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润化细胞培养箱中孵育（此后简称“组织培养箱”）。转染后 5 小时更换培养基（可选）。

3. 检测转染或诱导效率

1. 转染后24小时，在荧光显微镜下观察细胞以检测转染效率（或诱导表达GFP的对照HEK293T-REx稳定细胞系）。再孵育24小时。

4. STREP 亲和纯化（STREP AP）

1. 收集细胞
   1. 转染后48小时，弃去培养基，加入8 ml预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）。用移液器吹打数次，使细胞从培养板上脱落。
   2. 收集细胞悬液并转移至15 mL离心管中，在800 x g条件下离心沉淀细胞 g 4分钟，4℃ °C.
   3. 移除 PBS 上清液。重复离心（800 x g 4℃下持续1分钟 °C）以去除残留的 PBS。将细胞沉淀于 -80 ℃ 保存 °C 以供将来使用，或按照以下步骤继续进行蛋白质纯化。
2. 裂解细胞
   1. 使用 5 重悬细胞沉淀× 细胞沉淀体积（约250 µ每块平板加入适量被动裂解缓冲液（PLB：20 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，1.5 mM MgCl₂）₂，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂混合物片剂，5% v/v 甘油，以及1.0% NP-40），并将细胞悬液转移至1.5 ml 微量离心管中。
   2. 短暂涡旋混匀，4℃下振荡孵育30分钟 °C.
   3. 将细胞悬液在10,000 x g下离心 g 4℃下孵育10分钟 °C.
   4. 将可溶性裂解物转移至新的1.5 ml微量离心管中，弃去细胞沉淀。保留可溶性裂解物终体积的10%作为“STREP AP Input”。4 ℃保存 °C.
3. 平衡 STREP 珠
   注意： 第一步亲和纯化使用STREP磁珠！使用STREP磁珠下拉的复合物所回收的蛋白量显著高于使用FLAG磁珠下拉的复合物。
   1. 取出 (n × 40 µl) + n µ50% STREP磁珠悬液 l（n = 样品数量），在1,500 x g下离心沉淀 g 4℃下持续2分钟 °C.
      ​注意： 使用宽口吸头移取磁珠。
   2. 移去上清液，加入 500 µ将 PLB 加入珠子中。在 4 ℃ 下轻轻振荡混合珠子溶液 5 分钟。 °C. 以 1,500 x g 4℃下持续2分钟 °C.
      1. 重复洗涤共3次。将珠子重悬于PLB中，最终体积为n × 40 µl.
   3. 加入40 µ将50% STREP磁珠悬液各l加入每份细胞裂解液样品中，4℃下振荡孵育2小时 °C.
4. STREP AP
   1. 以 1,500 x g 离心溶液 g 4℃下持续2分钟 ˚C.
   2. 移除上清液，并将其作为“STREP AP 穿流液（FT）”于 4 ℃ 保存 °C.
   3. 加入500 µSTREP AP 洗涤缓冲液 I（20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂）1 升₂，1 mM DTT，5% 甘油和 0.2% NP-40）加入珠子中。4 ℃下轻轻振荡孵育珠子混合物 5 分钟 °C，然后以1,500 x g离心 g 4℃下持续2分钟 °C. 弃去上清液。
      1. 重复上述步骤，共洗涤4次。
         注意： 第四次洗涤前，将珠子溶液转移至新的1.5 ml微量离心管中，以降低蛋白背景。此步骤至关重要。
   4. 加入500 µl 用洗涤缓冲液 II（100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl 和 1 mM EDTA）重悬磁珠，并通过倒置离心管使磁珠充分平衡。在 1,500 x g 4℃下持续2分钟 °C，弃去上清液。
   5. 用50洗脱目标蛋白 µ100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM EDTA 和 2.5 mM Desthiobiotin 组成的 STREP 洗脱缓冲液。在 4℃ 下以 800 rpm 涡旋振荡 15 分钟 °C.
   6. 以 1,500 x g 离心磁珠 g 4℃下持续1分钟 °C. 收集上清液。该组分对应于“STREP AP 洗脱”样品。
   7. 4°C 下保存珠子组分 °进行第二次洗脱，可获得第一次洗脱所得蛋白量约一半的蛋白。取STREP AP洗脱液的10%用于银染和/或Western印迹分析。
5. 平衡 FLAG 琼脂糖珠
   1. 取出（n × 16） µl) + n µl FLAG磁珠溶液（n = 样品数量），在1,500 x g下离心沉淀 g 4℃下持续2分钟 °C.
      ​注意： 使用宽口吸头移取磁珠。
   2. 移去上清液，加入 500 µ加入100 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM EDTA 和 0.1% NP-40 的FLAG洗涤缓冲液至珠子中。在1,500 × g下离心沉淀 g 4℃下持续2分钟 °C. 重复上述步骤，共洗涤3次。
   3. 用 FLAG 洗涤缓冲液重悬珠子，终体积为 n × 16 µl.
   4. 加入16 µ将 FLAG 珠浆液加入剩余的 STREP AP 洗脱液中，4 ℃ 轻柔旋转孵育过夜 °C.

5. FLAG 免疫沉淀

1. 在 4 °C 条件下，以 1,500 x g 离心 FLAG 磁珠悬液 2 分钟。保留上清液，并将其作为“FLAG 免疫沉淀上清”（FT）于 4 °C 保存。
2. 向溶液中加入 500 µl FLAG 洗涤缓冲液，在 4 °C 下翻转孵育 5 分钟，然后在 4 °C 下以 1,500 x g 离心 2 分钟。共重复洗涤 4 次，每次离心后弃去上清液。
   注意：在第四次洗涤前，将蛋白-磁珠溶液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，以降低背景信号。此步骤至关重要。
3. 最后一次离心后弃去上清液，向磁珠中加入 30 µL 含有 200 ng/µl FLAG 肽的 FLAG 洗涤缓冲液。在 4 °C 下以 800 rpm 涡旋振荡 2 小时。
4. 将悬液在 4 °C 下以 1,500 x g 离心 2 分钟，收集上清液并作为“FLAG 免疫沉淀洗脱液”于 4 °C 保存。
   注意：可通过银染和/或 Western 印迹标准方案检测洗脱样品，并可用于进一步的蛋白分析。进行 Western 印迹时，应同时上样以下所有样品：(1) STREP 亲和纯化输入样品（STREP AP Input），(2) STREP 亲和纯化上清（STREP AP FT），(3) STREP 亲和纯化洗脱液（STREP AP Elution），(4) FLAG 免疫沉淀上清（FLAG IP FT），以及 (5) FLAG 免疫沉淀洗脱液（FLAG IP Elution）。各实验需自行确定上样体积。所有收集的样品和磁珠均可于 4 °C 短期保存，或于 -80 °C 长期保存。TAP 样品可采用质谱分析，以验证其组分身份、鉴定新的翻译后修饰（PTMs），和/或发现与纯化复合物发生的新蛋白相互作用。为此目的，在进行考马斯亮蓝染色或银染后，可使用洁净的手术刀从凝胶中切下目标条带。此前已有若干关于质谱分析方法的优秀综述发表。

结果

表1：本研究中使用的质粒。 CycT1 和 CDK9 被连接至pcDNA/4TO-STREP和pcDNA/4TO-FLAG质粒载体中。将这些构建体转化至DH5α感受态细胞，并涂布于LB-氨苄青霉素平板上。筛选菌落，进行培养和鉴定。通过Sanger测序以及限制性酶切联合琼脂糖凝胶电泳验证成功连接的克隆。对于CycT1，我们使用了较短版本（1 - 708），而非全长序列（1 - 726），因为其最后18个残基包含一个PEST序列（富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的肽段），该序列可作为蛋白质降解的信号肽。CDK9为全长序列。串联STREP标签的序列为：GGGGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK。串联FLAG标签的序列为：GGGGDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK。

蛋白质

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Fisher Scientific	SH30022FS
胎牛血清	Hyclone	SH30071
青霉素/链霉素	Fisher Scientific	MP091670049
PolyJet	Fisher Scientific	50-478-8
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836153001
STREP-Tactin Superflow	IBA	2-1208-010
STREP-tag 洗脱缓冲液	IBA	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 亲和凝胶	Sigma	SLBQ1981V
Corning 100mm × 20 mm 细胞培养处理无热原聚苯乙烯培养皿，20个/袖套	Corning	430167
蛋白质低吸附Eppendorf管	Fisher Scientific	13-698-794
数字涡旋混合器	Fisher Scientific	02-215-370
48孔微量离心管泡沫架	Fisher Scientific	02-215-386
Labquake 摇床旋转器	Thermo	415110