利用传感器芯片通过表面等离子共振研究生物分子相互作用

摘要

来源：Maier, I. 设计抗病毒药物 通过 表面等离子体共振 视频实验杂志 (2022)

本视频介绍了利用传感器芯片研究两种分子相互作用的表面等离子体共振（SPR）技术。通过检测两种分子结合与解离过程中共振角的变化以及反射光强度的变化，可以获得这两种分子间相互作用的信息。

方案

在本研究中，使用了CVN-小泛素样修饰蛋白（SUMO）融合蛋白代替CV-N进行酶联免疫吸附测定，且该融合蛋白适用于基于细胞的检测。重组全长甲型流感病毒血凝素H3蛋白可从商业途径获得（见材料表），或根据标准方案在哺乳动物HEK293细胞系以及杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。武汉-1刺突蛋白在哺乳动物HEK293细胞中表达。单甘露糖基化肽（MM）和双甘露糖基化肽（DM）的合成使得均一的配体可用于检测CVN2以及单甘露糖基化小分子。

1. 创建 CV-N 结构

1. 针对每种CVN2变体及CVN2L0蛋白（PDB编号3S3Y），从商业来源获取带有N端pelB信号肽序列和His标签的pET27b(+)载体基因构建体（见表1）。
2. 在CVN2L0模板基因背景下获得CVN2L0及其变体（V2、V3、V4和V5；图1A,C），该模板基因包含两个不同的DNA序列，分别对应每个CV-N重复单元。
3. 将冻干的质粒DNA溶解于无菌去离子蒸馏水（ddH₂O）中，终浓度为100 ng/µL。

2. 含质粒DNA转化细胞的LB琼脂平板的制备

1. 通过将蛋白胨（10 g/L）、酵母提取物（5 g/L）和 NaCl（5 g/L）溶解于 ddH₂O 中（参见材料表）来配制 LB-Lennox 培养基，并将 pH 调整至 7.4。采用化学法对每种变异株（V2-V5）进行转化，转入感受态 E. coli BL21 (DE3)，操作步骤参照先前发表的文献。
2. 将溶液分为两份（900 µL 和 100 µL），取 100 µL 转移至 LB-琼脂平板（含 50 µg/mL 卡那霉素），并用无菌涂布棒轻轻涂布均匀。将琼脂平板于 37 °C 培养过夜。

3. 克隆

1. 参照文献，将CV-N基因亚克隆至pET11a的NdeI和BamHI位点（参见材料表），用于转化（电穿孔）电感受态细胞。

4. 定点突变

1. 以包含两个不同DNA序列的CVN2L0模板基因为基础，生成CVN2L0及突变体CVN-E41A，每个CV-N重复序列对应一个特异DNA序列。
2. 使用定点突变试剂盒（见材料表）和特异性突变引物5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3'与5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3'进行PCR扩增以引入突变。
   1. 使用不同浓度的双链DNA（dsDNA）模板（范围为5–50 ng，例如5、10、20和50 ng）启动一系列样本反应，保持引物浓度恒定。
      注意：PCR反应体系及热循环程序通常按照定点突变试剂盒说明书中的建议进行。
3. 在矿物油覆盖层下方加入DpnI限制性内切酶（1 µL，10 U/µL，见材料表）。轻柔而充分地混匀反应液，在台式微量离心机中离心1分钟，随后立即于37 °C孵育1小时，以消化亲本的超螺旋dsDNA。

5. 细菌细胞的转化

1. 将XL1-Blue超感受态细胞（见材料表）在冰上轻轻解冻。为转化每个对照和样品反应，取50 µL超感受态细胞分装至预冷的聚丙烯圆底管（14 mL）中。
   1. 从每个对照和样品反应（突变的单链DNA）中取1 µL经Dpn I处理的单链DNA（ssDNA），分别加入不同的超感受态细胞分装管中，这些细胞将合成互补链。轻轻旋转混匀转化反应体系，并在冰上孵育30分钟。
      注意：在将经Dpn I处理的DNA加入转化反应前，建议小心地从移液枪头上去除残留的石蜡油。作为可选对照，可通过将0.1 ng/µL的pUC18对照质粒（1 µL）与50 µL超感受态细胞混合，检测XL1-Blue超感受态细胞的转化效率。
2. 将转化反应在42 °C下进行45秒热激处理，随后立即置于冰上冷却2分钟。
   注意：上述热激条件已针对所提及的聚丙烯圆底管（14 mL）条件优化。
3. 加入0.5 mL NZY+培养基（每升含：NZ胺（酪蛋白水解物）10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g、1 M MgCl₂ 12.5 mL、1 M MgSO₄ 12.5 mL、2 M葡萄糖10 mL，pH 7.5，预热至42 °C），将转化反应在37 °C、225–250 rpm振荡条件下孵育1小时。将各转化反应的适当体积（对照质粒转化取5 µL；样品转化取250 µL）涂布于LB-氨苄青霉素琼脂平板上。
   注意：对于转化对照和定点突变实验，应将细胞涂布于含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-gal，80 µg/mL）和异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃苷（IPTG，20 mM）的LB-氨苄青霉素琼脂平板（见材料表）。挑取单个转化后的E. coli菌落接种至50 mL培养液中，用于纯化突变质粒DNA以进行后续分析。突变结果通过外部测序服务进行DNA测序确认。

6. 表达与蛋白纯化

1. 对于大规模培养，用转化平板上的单个菌落接种少量含氨苄青霉素的 LB 培养基。
2. 利用过夜培养物，将表达培养物接种并添加以下成分：10 mM MgCl₂、10 mM MgSO₄ 和 20 mM 葡萄糖，将种子培养物按 1/100 比例稀释。
   1. 在 37 °C 下剧烈振荡培养细胞，待细胞在 600 nm 处的吸光度（Abs）达到 0.4–0.6（对数中期）后，将培养物冷却至 20 °C，加入 1 mM IPTG 诱导表达，并继续培养过夜。
   2. 随后在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 15 分钟收集细胞，并用移液器弃去上清液。
3. 将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中，在 4 °C 下以 4,000 × g 再次离心 15 分钟，然后用移液器弃去上清液。将剩余沉淀重悬于 10 mL 裂解缓冲液中，在 37 °C 下孵育 1 小时。
   注意：裂解缓冲液的组成：50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、2% Triton-X 100、500 ng/mL 溶菌酶、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、1 mM 二硫苏糖醇、1 mM MgCl₂，pH 8（参见材料表）。
   1. 将混合物进行两次冻融循环（-80 °C），在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 15 分钟，分离可溶性与不溶性组分，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），特别是十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE 进行分析（图 1B、C）。
      注意：细胞裂解可通过多种方法实现，例如冻融、超声处理、均质化、酶解裂解，或上述方法的组合。建议从包涵体中纯化以获得较高的蛋白产量。
4. 使用 Ni-NTA 柱层析法纯化蛋白（参见材料表）。将可溶性组分以 1 mL/min 的流速上样至再生的 Ni-NTA 微珠柱。在开始梯度洗脱前，先用 TBS 缓冲液（50 mM Tris、150 mM 氯化钠，pH 7.5）洗涤系统，随后进行梯度洗脱（在 60 分钟内，TBS 中咪唑浓度从 0% 升至 100%，含 500 mM 咪唑），并以 1 mL/min 的流速收集洗脱组分。将纯化后的蛋白在 100 mM PBS 中透析，用于生化表征（图 1C、D）。
5. 或者，可在 14 mL 离心管中使用 His-Select Ni²⁺ 亲和凝胶（参见材料表），分别用含 20 mM 和 250 mM 咪唑的缓冲液结合并重悬带有 His 标签的重组表达 CV-N 蛋白，批式孵育至少 30 分钟。
   注意：可将这些半纯化蛋白上样至一次性预装柱，用于缓冲液置换及生物样品（如碳水化合物和蛋白质）的纯化处理，该柱可承载来自固定化金属亲和层析的 1–1.5 mL 洗脱液。
6. 将蛋白溶液转移至装有 10 kDa 截留分子量滤膜的离心管（参见材料表），在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 10 分钟进行浓缩。对于 SPR 测量，将分析物溶液置换为 10 mM HEPES、150 mM 氯化钠、3 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）和 0.05% Tween20，pH 7.4（HBS-EP(+)，参见材料表）。
   1. 将 SPR 运行缓冲液按 1:10 比例稀释，加至样品中，并在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 10 分钟，重复此步骤四次，每次恢复至初始体积。
7. 使用 NanoDrop 紫外-可见分光光度计（参见材料表）在 280 nm 处测定蛋白浓度，依据主蛋白 CVN2L0 的计算消光系数（20,440 M^-1 cm^-1）进行计算，该蛋白分子量为 23,474 Da。以 PBS（100 mM，pH 7.0）或 SPR 缓冲液作为空白对照，分别在三个稀释梯度（1:1、1:10 和 1:100）下测定蛋白浓度。

7. SPR 光谱法

1. 使用双通道 SPR 系统（参见材料表），以 HBS-EP(+) 作为运行缓冲液，10 mM 盐酸甘氨酸（pH 1.5–1.6）作为再生缓冲液。开启仪器、脱气装置、自动进样器和泵，用 ddH₂O 清洗整个系统 1 小时。将准备好的运行缓冲液置于单独的瓶中。
2. 在检测器上滴加浸油，然后将玻璃传感器芯片（参见材料表）安装至三通道流通池下方的检测器上，该芯片表面镀有薄金膜，并在上侧修饰有羧甲基葡聚糖水凝胶。通过下拉操作手柄固定装置。
   注意：C19RBDHC30M 200 nm 链霉亲和素衍生的羧甲基葡聚糖水凝胶芯片，其生物素化的严重急性呼吸综合征冠状病毒-2 受体结合域蛋白为中等密度，是一种配体已预先固定化的即用型传感器芯片。

8. CV-N 与 HA、S 蛋白及 RBD 结合的 SPR 结合实验

1. 按照以下步骤将蛋白质配体固定到传感器芯片上。
   1. 单击以打开运行表格 表格 在菜单栏中 运行表格编辑器 在集成的 SPRAutoLink 软件中（参见 材料清单）。选择并点击 基础固定 从可用的运行表格列表中选择，并按照计算机屏幕上的实验步骤操作。所使用的相应样本编辑器显示在右上角。
   2. 点击 样本集编辑器 在“表单”部分填写放置于自动进样器中用于后续分析的两个样品架的试剂列表。点击 自动进样器直接控制 在菜单栏中选择“工具”以将架子向前或向后移动至原位。选择 4 °C 作为操作温度。
      注意： SPR 软件支持“SPR 仪器直接控制”和“泵直接控制” 通过 选择相应的工具，以及自动进样器操作，并通过点击 表格；也 运行表格编辑器，数据-绘图，或 后期处理 可选择进行数据分析。文件将直接保存在默认目录中，并从“后处理”窗口导出为 scrubber.files。
2. 启动泵以注入ddH₂O₂0，通过单击 工具 和 泵直接控制 并点击记录数据 SPR仪器直接控制，每次 开始 在新出现的窗口中。将偶联试剂（步骤 8.3）放入 300 µL 小瓶中，置于自动进样器样品架中，然后通过点击启动运行表格 运行.
   注意： 芯片表面使用10 mM甘氨酸缓冲液（pH 9.0）进行预处理，或用1 M氯化钠和0.1 M硼酸钠缓冲液（pH 9.0）冲洗，以对羧基修饰的芯片表面进行预处理，便于后续EDC/NHS活化混合液的反应。
3. 对于这种简单的蛋白质-蛋白质相互作用，使用 CMD500D 芯片（参见 材料表) 以生成一个固定化透明质酸（HA）的微折射率单位（µRIU = 2500 - 3000）流通池，以及一个固定刺突蛋白的微折射率单位（µRIU = 400）流通池。在15 µL/min的灌注流速下，依次执行以下步骤，注入等体积混合的0.4 M盐酸N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC*HCl）和0.1 M N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）水溶液。
   1. 以25,000 µL/min的流速重新填充泵，进行30秒基线校准，注入90 µL样品活化溶液（EDC/NHS），接触时间6分钟，随后保持5分钟。
   2. 在左侧流路（蓝色）以10 µL/min流速运行1 min作为基线后，重复此循环，注入并固定浓度为20 µg/mL的化学合成肽、HA和刺突蛋白，并随后用ddH₂O进行基线调整₂O 继续反应 1.5 分钟，然后用 1 M 盐酸乙醇胺（pH 8.5）淬灭活化的芯片表面。
4. 将管路从液体进样器切换至脱气装置中的 ddH₂O₂0 加入含 HBS-EP(+) 的瓶中（图2).
5. 分析 SPR 传感图
   1. 为了进行动力学研究，使用不同浓度的分析物（10^-5-10^-8 M），每次注射后进行再生步骤，并在不同分析物之间进行空白测量。将流速更改为10 µL/min，开始注射，接触时间为4 min，随后生成5 min基线，并进行两次再生步骤，每次2 min，间隔30 s。
   2. 注入缓冲液进行空白测量，其传感器图将从样品运行中扣除，以校正不同蛋白质浓度的影响。
6. 点击 表格，向下滚动，然后单击此操作模式，切换至“Post-Processing”（后处理）。单击 添加 在数据绘图界面中，为每个流动池选择随时间生成的结合曲线，并将叠加结果导出为scrubber文件（.ovr）。点击“File”以打开文件保存选项。通过比对并左对齐和右对齐曲线，从配体通道信号中减去第二参考通道信号，获得响应曲线。
   注意： 通过计算方式定义传感图，对数据进行“后期处理”操作。可将数据以左侧和右侧流路细胞的传感图叠加形式呈现，或表示为两个通道传感图之差。
7. 在结合测量前后，使用 50–100 mM pH 9.5 甘氨酸缓冲液、水和 20% 乙醇彻底清洗整个流体系统，以去除盐分或蛋白质污染残留；必要时可采用更严格的清洗方式，使用 0.5% SDS 和甘氨酸缓冲液。
   注意： 为防止仪器损坏，若芯片曾保存在缓冲液中或处于100%湿度环境下，建议在将芯片盒重新插入仪器前，检查玻璃芯片的机械稳定性。

表1：采用Langmuir 1:1结合模型，通过SPR传感图获得的CVN2L0及Cys-Cys键合变体V2、V4和V5与HA结合的动力学数据。K_D [M] = k_off/k_on 或 k_d/k_a。所有数据均在25 °C的HBS-EP(+)缓冲液中获得。

分析物	k在 [ M-1*-1]	k关闭 [ s-1]	KD
CVN2L0	5.1 e3	1.3 e-3	255 nM
V2	4.0 × 10³	1.1 e-3	275 nM
V4	1.2 e3	1.3 e-3	11 µM
V5	1.2 e3	5.8 e-2	5 µM

结果

图1：CV-N序列与表达。（A）在pET11a载体中于E. coli内表达的CVN2，其两个CV-N重复单元之间无连接肽（每个重复单元含101个氨基酸），并具有四个二硫键。（B）CV-N（单体）和CVN2（二聚体）两个独立克隆的表达情况。（C）二硫键突变体经纯化后进行SDS-PAGE分析。使用低分子量标记物（6 µL）作为参照。WT = CVN2L0，含有如（A）中标注的四个二硫键。V2为在58和73位以极性残基取代二硫键的变体。V3–V5为保留两个S-S键的变体，其取代氨基酸分别为极性（C58E-C...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Äkta primeplus	Cytiva
Amicon 超滤离心管	Merck	C7715
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A5354
Beckman Coulter Allegra X-30R 冷冻离心机	Beckman Coulter	B06320
细胞涂布棒	Sigma-Aldrich	HS86655	银色不锈钢，棒长 33 mm
定制 DNA 寡核苷酸	Sigma-Aldrich	OLIGO
定制基因合成	GenScript	#1390661 	克隆载体：pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ 缓冲液 10，4×50 mL	Thermo Scientific	50-105-5354
Dionex UltiMate 3000	Thermo Scientific	IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I 限制性内切酶（10 U/μL） 	Fisher Scientific	ER1701
DTT	Merck	DTT-RO
EDC	Merck	39391
EDTA	Merck	E9884
Eppendorf Safe-Lock 管	Eppendorf	30120086
Eppendorf Safe-Lock 管	Eppendorf	30120094
Eppendorf Minispin 和 MiniSpin Plus 个人微型离心机	Sigma-Aldrich	Z606235
乙醇	Merck	51976
乙醇胺盐酸盐	Merck	E6133
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 14 mL 圆底聚苯乙烯试管，带卡扣盖，无菌，25/包	Corning	352057
葡萄糖	Merck	G8270
甘氨酸盐酸盐	Merck	55097
HA H3 蛋白	Abcam	ab69751
HEPES	Merck	H3375
His-select Ni2+	Merck	H0537
咪唑	Merck	I2399
IPTG	Merck	I6758
卡那霉素 A	Sigma-Aldrich	K1377
Kromasil 300-5-C4	Nouryon
LB 琼脂	Merck	52062
LB 琼脂	Merck	19344
LB Lennox	Merck	L3022
溶菌酶	Merck	10837059001
氯化镁	Merck	M8266
硫酸镁	Merck	M7506
NaH2PO4	Merck	S0751
NanoDrop UV-Vis2000c 分光光度计	Thermo Scientific	ND2000CLAPTOP
NaOH	Merck	S5881
NHS	Merck	130672
NZ 胺（酪蛋白水解物）	Merck	C0626
PBS	Merck	806552
PD MidiTrap G-10	Sigma-Aldrich	GE28-9180-11
蛋白胨	Merck	70171
pET11a	Merck Millipore (Novagen)	69436 
PMSF	Merck	PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（1000）	Qiagen	27106X4
Reichert 软件包 Autolink1-1-9	Reichert
Reichert SPR SR7500DC 双通道系统	Reichert
用于数据分析的 Scrubber2-2012-09-04	Reichert
SDS	Merck	11667289001
定点突变试剂盒（含 pUC18 对照质粒）	Stratagene	#200518
氯化钠	Merck	S9888
三水合乙酸钠	Merck	236500
SPR 传感器芯片 C19RBDHC30M	XanTec bioanalytics	SCR C19RBDHC30M
SPR 传感器芯片 CMD500D	XanTec bioanalytics	SCR CMD500D
Sterilin 标准 90 mm 培养皿	Thermo Scientific	101R20
TBS	Merck	T5912	10× 溶液
吐温-100	Merck	T8787
胰蛋白胨	Merck	93657
吐温-20	Merck	P1379
Vortex-Genie 2 混匀器	Merck	Z258423
X-gal	Merck	XGAL-RO
XL1-Blue 超级感受态细胞	Stratagene	#200236
酵母提取物	Merck	Y1625