表面等离子体共振，使用传感器芯片研究生物分子相互作用

Abstract

来源:Maier， I. 通过表面等离子体共振工程抗病毒剂。J. Vis. Exp. （2022 年）

该视频介绍了使用传感器芯片研究两个分子之间相互作用的表面等离子体共振 （SPR） 技术。共振角的变化和反射光的强度被检测为两个分子缔合和解离的函数，这提供了有关两个分子之间相互作用的信息。

Protocol

在本研究中，CVN 小泛素样修饰物 （SUMO） 融合蛋白已用于酶联免疫吸附测定，而不是 CV-N，适用于基于细胞的测定。重组全长甲型流感病毒 HA H3 蛋白可市售（参见材料表）或根据标准方案在哺乳动物 HEK293 细胞系和杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。Wuhan-1 刺突蛋白在哺乳动物 HEK293 细胞中表达。壆甘露糖基化肽 （MM） 和二甘露糖基化肽 （DM） 的合成可检测 CVN2 和单甘露糖基化小分子的均相配体。

1. 创建 CV-N 结构

1. 对于每个 CVN2 变体和 CVN2L0 蛋白 （PDB ID 3S3Y），从商业来源获得具有 N 末端 pelB 前导序列和 pET27b（+） 载体中 His 标签的基因构建体（见表 1）。
2. 获取 CVN2L0 及其变体（V2、V3、V4 和 V5;图 1A、C） 在 CVN2L0 模板基因的背景中，该模板基因由每个 CV-N 重复序列的两个不同 DNA 序列组成。
将
3. 冻干质粒 DNA 溶解在无菌去离子蒸馏水 （ddH₂O） 中，至终浓度为 100 ng/μL。

2. 用质粒 DNA 转化的细胞制备 LB 琼脂平板

1. 通过将 10 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母提取物和 5 g/L NaCl 溶解在 ddH₂O 中来制备培养基 LB-Lennox（参见材料表），并将 pH 值调节至 7.4。根据先前发表的报告，通过化学方法将每个变体 （V2-V5） 转化为感受态大肠杆菌 BL21 （DE3）。
2. 分液（900 μL 和 100 μL），在 LB 琼脂平板（50 μg/mL 卡那霉素）上转移 100 μL，然后轻轻使用无菌细胞铺展器。将琼脂平板在 37 °C 下孵育过夜。

3. 克隆

1. 将 CV-N 基因亚克隆到 pET11a 的 NdeI 和 BamHI 位点（参见材料表），以便按照参考转化（电穿孔）到电感受态细胞。

4. 定点诱变

1. 在 CVN2L0 模板基因的背景中生成 CVN2L0 和突变体 CVN-E41A，该模板基因包含每个 CV-N 重复序列的两个杰出 DNA 序列。
2. 使用定点诱变试剂盒（参见材料表）和特异性诱变引物 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' 和 5'-cctgaactcttttcgcaaacgttgacggttctc-3' 进行突变以运行 PCR。
   1. 使用 5-50 ng 的多种浓度的双链 DNA （dsDNA） 模板（例如 5、10、20 和 50 ng dsDNA 模板）开始一系列样品反应。保持引物浓度恒定。
      注意:PCR 混合物和热循环方案通常按照定点诱变试剂盒说明手册中的说明使用。
3. 在矿物油覆盖层下方添加 DpnI 限制性内切酶（1 μL，10 U/μL，参见材料表）。彻底温和地混合反应物，在台式微量离心机中离心 1 分钟，并立即在 37 °C 下孵育 1 小时以消化亲本超螺旋 dsDNA。

5. 细菌细胞的转化

1. 在冰上轻轻解冻 XL1-Blue 超感受态细胞（参见材料表）。要转化每个对照和样品反应，请将超感受态细胞 （50 μL） 分装到预冷的聚丙烯圆底管 （14 mL） 中。
   1. 从每个对照和样品反应（突变的 ssDNA）中转移 1 μL Dpn I 处理的单链 DNA （ssDNA），以分离合成互补链的超感受态细胞的等分试样。小心旋转转化反应物以混合并在冰上孵育反应物 30 分钟
      注意:在将 Dpn I 处理的 DNA 转移到转化反应中之前，建议小心地从移液器吸头中取出任何残留的矿物油。作为可选对照，需要通过将 0.1 ng/μL 的 pUC18 对照质粒 （1 μL） 与 50 μL 等分的超级感受态细胞混合来检查 XL1-Blue 超感受态细胞的转化效率。
2. 在 42 °C 下对转化反应施加热脉冲 45 秒，然后将反应置于冰上 2 分钟
   注意:施加的热脉冲已针对聚丙烯圆底管 （14 mL） 中的上述条件进行了优化。
3. 加入 0.5 mL NZY+ 肉汤（每升含有:10 g NZ 胺（酪蛋白水解物）、5 g 酵母提取物、5 g NaCl、12.5 mL 1 M MgCl₂、12.5 mL 1 M MgSO₄、10 mL 2 M 葡萄糖，pH 7.5，并预热至 42 °C）并在 37 °C 下孵育转化反应，以 225-250 rpm 振荡 1 小时。将正确体积的LB-氨苄青霉素琼脂平板上的每个转化反应（5 μL 来自对照质粒转化;250 μL 来自样品转化）。
   注意:对于转化对照和诱变，将细胞铺展在具有 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal，80 μg/mL）和异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷（IPTG，20 mM）的 LB-氨苄青霉素琼脂平板上（参见材料表）。用转化的大肠杆菌细胞的单个菌落接种 50 mL 细胞培养物，以纯化突变的质粒 DNA 用于分析。诱变通过外部设施的 DNA 测序来确认。

6. 表达和蛋白纯化

1. 对于大规模培养，用转化板中的单个菌落接种少量 LB（含有氨苄青霉素）。
2. 使用过夜培养物，用添加剂接种表达培养物，例如 10 mM 的 MgCl₂、10 mM 的 MgSO₄ 和 20 mM 的葡萄糖，将种子培养物稀释至 1/100。
   1. 在 37 °C 下剧烈摇动培养细胞。在将细胞冷却至 20 °C 之前，在 0.4-0.6（中期对数期）之间将细胞培养至 Abs 600 nm。用 1 mM IPTG 诱导并生长过夜。
   2. 然后，通过在4°C下以4,000 x g 离心15分钟来收获细胞，并用移液管弃去上清液。
将
3. 细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 缓冲液中，并在 4°C 下以 4,000 x g 重新离心 15 分钟。然后，用移液管弃去上清液。将剩余的沉淀重悬于 10 mL 裂解缓冲液中，并将悬浮液在 37 °C 下孵育 1 小时><。 注意:裂解缓冲液的组成:（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、2% Triton-X 100、500 ng/mL 溶菌酶、1 mM 苯甲基磺酰氟 （PMSF）、1 mM 二硫苏糖醇、1 mM MgCl_2，pH 值 8，参见材料表）。
   1. 将混合物进行两次冻融循环 （-80 °C）。通过在4°C下以4,000×g离心15分钟来分离可溶性和不溶性级分，并使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析它们，特别是十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE（图1B，C><）。 注意:细胞可以通过多种方式裂解，例如冻融、超声处理、匀浆、酶裂解或这些方法的组合。建议从包涵体中纯化，以收集高产量的蛋白质。
4. 使用 Ni-NTA 柱层析纯化蛋白质（参见材料表）。将可溶性组分上样到再生的 Ni-NTA 珠柱 （1 mL/min） 上。用 TBS 缓冲液（50 mM Tris，150 mM 氯化钠，pH 7.5）洗涤系统，然后开始梯度（0-100% 500 mM 咪唑在 TBS 中，在 60 分钟内）和收集馏分（1 mL/min）。透析纯化的蛋白质以针对 100 mM PBS 进行生化表征（图 1C、D）。
5. 或者，在 14 mL 试管中使用 His-Select Ni^{2 +} 亲和凝胶（参见材料表），分别在 20 mM 咪唑和 250 mM 咪唑的缓冲溶液中结合和重悬 His 标记的重组表达的 CV-N。分批孵育至少 30 分钟。
   注意:将这些半纯化的蛋白质应用于一次性预装柱上，用于缓冲液置换和生物样品的纯化，例如碳水化合物和蛋白质，这些样品可以从固定的金属亲和层析中加载 1-1.5 mL 洗脱液。
6. 将蛋白质溶液转移到带有 10 kDa 截止过滤器的离心管中（参见材料表），并通过在 4,500 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟来浓缩它们。对于 SPR 测量，将分析物溶液交换为 10 mM HEPES、150 mM 氯化钠、3 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 和 0.05% Tween20，pH 7.4 （HBS-EP（+），参见材料表）。
   1. 将此 SPR 运行缓冲液加入稀释因子为 1:10 的稀释因子，并在 4,500 x g 和 4 °C 下离心四次至初始体积，持续 10 分钟。
7. 使用 NanoDrop 紫外-可见分光光度计（参见材料表）确定 280 nm 处的蛋白质浓度，基于计算出的主要蛋白质 CVN2L0 的消光系数 （20,440 M ^-1 cm ^{-1 -1}），显示大小为 23,474 Da。使用 PBS（100 mM，pH 7.0）或 SPR 缓冲液作为空白，并在三个稀释步骤（1:1、 1:10 和 1:100）。

7. SPR 光谱

1. 使用双通道 SPR 系统（参见材料表）和运行缓冲液 HBS-EP（+） 和 10 mM 甘氨酸盐酸盐 pH 1.5-1.6 作为再生缓冲液。打开仪器、脱气机、自动进样器和泵，然后用 ddH₂0 洗涤整个系统1 小时。将即用型电泳缓冲液放入单独的瓶子中。
2. 将浸油滴到检测器上，并将涂有薄金膜并在上侧用羧甲基葡聚糖水凝胶官能化的玻璃传感器芯片（参见材料表）直接安装到三端口流通池下方的检测器上。通过下拉 handling.
   来修复设置 注意:C19RBDHC30M 200 nm 链霉亲和素衍生的羧甲基葡聚糖水凝胶，具有中等密度的生物素化严重急性呼吸系统综合症冠状病毒-2 RBD 蛋白，是一种具有预固定配体的即用型传感器芯片。

8. CV-N 与 HA、S 蛋白和 RBD 结合的 SPR 结合试验

1. 按照以下步骤将蛋白质配体固定在传感器芯片上。
   1. 通过单击菜单栏中的"表单"和集成的 SPRAutoLink 软件中的"运行表编辑器"打开运行表（参见材料表）。从可用运行表列表中选择并单击 BASIC_Immobilization，然后按照计算机屏幕上的实验程序步骤进行作。使用的相应采样编辑器显示在右上角。
   2. 单击"表单"部分中的"样品组编辑器"，填写放置在自动进样器中的两个样品架的试剂列表，以便进一步分析。单击菜单栏中的 Autosampler Direct Control（自动进样器直接控制）作为"工具"，将样品架向前或返回原位。选择 4 °C 作为工作温度。
      注意:SPR 软件允许通过选择相应的工具以及自动进样器作和单击"表格"来实现"SPR 仪器直接控制"和"泵直接控制";还可以选择 Run Table Editor、Data-Plot 或 Post-Processing 来执行数据分析。文件直接保存在默认目录中，并从 Post-Processing （后期处理） 窗口导出为 scrubber.files。
2. 通过单击工具和泵直接控制启动泵以注入 ddH₂0，然后单击 SPR 仪器直接控制记录数据，每次在新出现的窗口中启动。将偶联试剂（步骤 8.3）放入 300 μL 样品瓶中，放入自动进样器架中，然后单击"Run"（运行）启动运行表
   注意:芯片表面使用 10 mM 甘氨酸缓冲液 pH 9.0 进行活化，或者可能用 1 M 氯化钠、0.1 M 硼酸钠缓冲液 pH 9.0 冲洗，以活化用于 EDC/NHS 活化混合物的羧基衍生芯片表面。
3. 对于这种简单的蛋白质-蛋白质相互作用，使用 CMD500D 芯片（参见材料表）生成具有固定化 HA 的微折射率单位 （μRIU） = 2500 - 3000 流通池和具有刺突蛋白的 μRIU = 400 流通池。以 15 μL/min 的进样流速，按以下顺序步骤进样 0.4 M N-乙基-N'-（二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐 （EDC*HCl） 和 0.1 M N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 的等水混合物。
   1. 以 25,000 μL/min 的速度重新填充泵，进行基线调整 30 秒，在 6 分钟接触时间内注入 90 μL 样品活化液 （EDC/NHS），然后再保持 5 分钟。
   2. 在仅在左侧流通池（蓝色）上以 10 μL/min 的基线运行 1 分钟后重复此循环，以 20 μg/mL 的速率注射和固定化学合成的肽、HA 和刺突蛋白，并允许随后用 ddH₂O 进行基线调整 1.5 分钟，然后用 1 M 乙醇胺盐酸盐 pH 8.5 淬灭活化的芯片表面。
4. 将试管从液体采样器切换到脱气机，从 ddH₂0 切换到带有 HBS-EP（+） 的瓶子中（图 2）。
5. 分析 SPR 传感图。
   1. 要进行动力学研究，请使用不同浓度的分析物 （10-5-10-8 M），每次进样后进行再生步骤，并在不同分析物后进行空白测量。将流速更改为 10 μL/min，开始进样 4 分钟接触时间，然后生成 5 分钟基线，以及两个 2 分钟的再生步骤，每个步骤的间隔为 30 秒。
   2. 注入缓冲溶液用于空白测量，从样品运行中减去其传感图以标准化不同的蛋白质浓度。
6. 单击 Form，向下滚动，然后单击此作模式更改为 "Post-Processing"。单击 Add（添加），在数据绘图表单中为每个流通池选择随时间生成的结合曲线，并将叠加层导出为洗涤器文件 （.ovr）。点击 文件 打开文件保存选项。通过对齐左右曲线并从配体通道的信号中减去第二个参考通道的信号来获得响应曲线。
   注意:数据通过计算定义传感器图在 "后处理" 中进行作。它被放入来自左侧和右侧流通池的传感器图叠加中，或表示为来自两个通道差异的传感器图。
7. 在结合测量前后，用 50-100 mM 甘氨酸缓冲液（pH 9.5）、水和 20% 乙醇清洁整个流路，以去除痕量盐或任何蛋白质污染，或者更严格的 0.5% SDS 和甘><氨酸。 注意:为防止仪器损坏，如果芯片已储存在缓冲液下或 100% 湿度下，建议在将芯片盒重新插入仪器之前检查玻璃芯片的机械稳定性。

表 1:使用 Langmuir 1:1 结合模型从 SPR 传感图获得的 CVN2L0 和 Cys-Cys 键变体 V2、V4 和 V5 与 HA 结合的动力学数据。K_D [m] = k_关闭/k_打开或 k_d/k_a。所有数据均在 25 °C 下在 HBS-EP（+） 缓冲液中生成。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 分析物 k_在 [^M-1*^s-1] 上 k_关闭 [^s-1] K_D CVN2L0 5.1 E3 1.3 ^E-3 255 纳米 V2 版本 4.0 E3 1.1 ^E-3 275 纳米 V4 版本 1.2 E3 1.3 ^E-3 11 微米 V5 版本 1.2 E3 5.8 ^E-2 5 微米

Results

图 1:CV-N 序列和表达。（A） 每个 CV-N 重复序列之间没有接头的 CVN2（每个 101 个氨基酸）和四个二硫键在 E 的 pET11a 载体中表达。大肠杆菌。（B） CV-N（单体）和 CVN2（二聚体）的两个独立集落的表达。（C） 在 SDS-PAGE 上纯化和分析二硫键变体。使用低分子量标记物 （6 μL） 作为参比。WT = CVN2L0 带有 （A） 中标记的四个二硫键。V2 是一种变体，在 58 和 73 位点被极性残基取代了二硫键。V3-V5 是具有两个剩余 SS 键的变体，极性 （C58E-C73R） 或非极性 （C58W-C73M） 取代氨基酸或这些残基对取代的组合。（D） 纯化的CVN2L0的HPLC色谱...

Materials