利用核磁共振研究原子水平的蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

来源：Winkelaar, G., 等. 利用核磁共振波谱法（NMR）和微尺度热泳法（MST）测量球状蛋白与丝状蛋白的相互作用. J. Vis. Exp. (2018).

本视频介绍了利用核磁共振波谱技术研究¹⁵N标记的野生型和突变型envoplakin蛋白与未标记的vimentin蛋白之间相互作用的方法。野生型envoplakin与vimentin成功相互作用会导致核磁共振谱图中谱线显著展宽和信号峰消失；而突变型envoplakin与vimentin之间缺乏相互作用，则在核磁共振谱图中呈现分辨良好的信号峰。

方案

1. 核磁共振方法

1. NMR 样品制备
   1. 使用 20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7 缓冲液纯化¹⁵N标记的野生型或 R1914E E-PRD 蛋白。蛋白储备液的浓度通常为 0.3 至 1 mM，体积约为 1 mL。
      注意：可使用截留分子量为 3 kDa、体积为 5 mL 的离心超滤装置将蛋白浓缩至>100 µM，以使浓度达到样品制备的合适范围。
   2. 使用 20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7 缓冲液纯化一份未标记的 VimRod 蛋白样品。
   3. 在最终体积为 500 µL 的溶液中，加入野生型或突变型 E-PRD 蛋白至终浓度为 100 µM，加入重水（D₂O）至终浓度为 10%（v/v），并加入 DSS（4,4-二甲基-4-硅代戊烷-1-磺酸）至终浓度为 20 µM。用 20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7 缓冲液补足体积至 500 µL。典型的样品制备方案见表 1。
      注意：DSS 在 0 ppm 处的共振峰用于校准¹H 化学位移，并间接参考蛋白的¹⁵N 化学位移。D₂O 用于提供氘锁信号，以保持核磁共振波谱....

结果

图 1：NMR 实验设置界面截图。 所示窗口用于设置标准实验以采集 HSQC 数据集。实验参数在“Experiment”（实验）选项旁读取。图中显示的 ZGPR 实验被选为初始实验，用于加载标准的、溶剂依赖的氢谱参数。“Title”（标题）窗口用于输入实验细节，以便记录存档。为采集 HSQC 谱图，需将 ZGPR 实验替换为 SFHMQC3GPPH。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化铵（<sup>15</sup>N，99%）	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-467	核磁共振同位素标记
D<sub>2</sub>O，重水（D，99.8%）	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-2259	核磁共振样品制备
DSS，2,2-二甲基-2-硅代戊烷-5-磺酸钠-D6（D，98%）	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-8206	核磁共振参考物质
精密5 mm核磁共振管，7&rdquo;长	SJM/Deuterotubes	BOROECO-5-7	核磁共振管
核磁共振波谱仪（14.1 特斯拉）	Bruker		核磁共振数据采集
TCI 5 mm z-PFG 低温探头	Bruker		核磁共振数据采集
软件
Bruker TopSpin 4.0.1	Bruker		核磁共振数据处理