利用核磁共振研究原子水平的蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

来源：Winkelaar, G., 等. 利用核磁共振波谱法（NMR）和微尺度热泳法（MST）测量球状蛋白与丝状蛋白的相互作用. J. Vis. Exp. (2018).

本视频介绍了利用核磁共振波谱技术研究¹⁵N标记的野生型和突变型envoplakin蛋白与未标记的vimentin蛋白之间相互作用的方法。野生型envoplakin与vimentin成功相互作用会导致核磁共振谱图中谱线显著展宽和信号峰消失；而突变型envoplakin与vimentin之间缺乏相互作用，则在核磁共振谱图中呈现分辨良好的信号峰。

方案

1. 核磁共振方法

1. NMR 样品制备
   1. 使用 20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7 缓冲液纯化¹⁵N标记的野生型或 R1914E E-PRD 蛋白。蛋白储备液的浓度通常为 0.3 至 1 mM，体积约为 1 mL。
      注意：可使用截留分子量为 3 kDa、体积为 5 mL 的离心超滤装置将蛋白浓缩至>100 µM，以使浓度达到样品制备的合适范围。
   2. 使用 20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7 缓冲液纯化一份未标记的 VimRod 蛋白样品。
   3. 在最终体积为 500 µL 的溶液中，加入野生型或突变型 E-PRD 蛋白至终浓度为 100 µM，加入重水（D₂O）至终浓度为 10%（v/v），并加入 DSS（4,4-二甲基-4-硅代戊烷-1-磺酸）至终浓度为 20 µM。用 20 mM Tris-HCl、1 mM DTT、pH 7 缓冲液补足体积至 500 µL。典型的样品制备方案见表 1。
      注意：DSS 在 0 ppm 处的共振峰用于校准¹H 化学位移，并间接参考蛋白的¹⁵N 化学位移。D₂O 用于提供氘锁信号，以保持核磁共振波谱仪在恒定的净磁场下运行。
   4. 按照上一步的方法配制第二份 E-PRD、D₂O 和 DSS 样品，并在补足体积至 500 µL 前加入 VimRod 至终浓度为 50 µM。
   5. 将 500 µL 的样品转移至 5 mm 直径的 NMR 样品管中进行实验。

2. 核磁共振实验设置

1. 打开气流，使用弹出命令“ej”将样品从磁体中升起。随后，将样品放置在磁体顶部的转子中，并通过开口插入，使用命令“ij”将其装入。在继续操作前，请等待样品在磁体内部完全稳定。
2. 使用“edc”命令创建新数据集并加载标准 ¹H NMR 参数，选择实验“ZGPR”（图1）。填写“NAME”（姓名）、“EXPNO”（实验编号）和“PROCNO”（处理后数据文件夹编号）字段。在“Set solvent”（设置溶剂）字段中选择溶剂，然后点击“Execute ‘getprosol’”（执行“getprosol”）以读取标准探头及溶剂依赖性（prosol）参数。
3. 将样品锁定至氘代溶剂 即， D₂O，使用“lock”命令，等待其完成扫描并实现锁定。
4. 使用自动调谐命令“atma”调节样品，以校正磁体的共振频率。监测进动曲线，直至自动调谐完成。
5. 使用 TOPSHIM（命令“topshim”）对磁场进行匀场。匀场是指调整磁场以使样品周围磁场均匀的过程。若使用相同或相似样品，建议在执行 topshim 前使用“wsh”命令保存匀场值，并用“rsh”命令读取这些值。
6. 使用“rga”命令调节接收增益，以获得最大信噪比。
7. 将谱图中心置于水共振偏移（o1）处，并使用“calibo1p1”以高功率设置90度质子脉冲（p1）。
8. 使用“zg”命令采集质子谱，并用“efp”进行处理，该处理包括指数乘法（“em”）、对自由感应衰减（FID）施加线宽展宽、“ft”对FID进行傅里叶变换，以及“pk”进行相位校正。
9. 使用无积分选项的多项式进行自动相位校正“apk”和自动基线校正“absn”。
10. 在实验中选择“SFHMQC3GPPH”以创建一个新的数据集（如1.2.2所述）。
11. 从质子谱中复制优化后的 P1 和 O1 参数，并使用命令“getprosol 1H p1 plw1”设置 P1 相关脉冲，其中 p1 为优化后的 P1 值，plw1 为 P1 的功率水平。
12. 优化 CNST54 常数以设置酰胺化学位移的偏移量，优化 CNST55 以定义带宽，从而覆盖感兴趣的谱图区域，以便优化接收增益（图2）。为了选择这些参数，从二维谱中提取第一个FID（自由感应衰减）信号，并根据观测到的信号来确定参数。此外，通过使用命令“gs”实时监测数据质量，调整弛豫延迟（D1）、扫描次数（NS）和预扫描次数（DS），以获得可接受的信号灵敏度。
13. 使用 Zero Go “zg” 记录谱图。

表1. 核磁共振样品制备。

样品	缓冲液 A 中的 1 mM E-PRD (µL)	缓冲液 A1 中的 1 mM VimRod (µL)	缓冲液 A (µL)	D2O 中的 200 µM DSS (µL)	缓冲液 B2 (µL)	总体积 (µL)
E-PRD 单独	50	0	50	50	350	500
E-PRD + VimRod	50	50	0	50	350	500
1缓冲液 A：20 mM Tris-HCl，1 mM DTT，pH 7
2缓冲液 B：23 mM Tris-HCl，1.14 mM DTT，pH 7

结果

图 1：NMR 实验设置界面截图。 所示窗口用于设置标准实验以采集 HSQC 数据集。实验参数在“Experiment”（实验）选项旁读取。图中显示的 ZGPR 实验被选为初始实验，用于加载标准的、溶剂依赖的氢谱参数。“Title”（标题）窗口用于输入实验细节，以便记录存档。为采集 HSQC 谱图，需将 ZGPR 实验替换为 SFHMQC3GPPH。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化铵（<sup>15</sup>N，99%）	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-467	核磁共振同位素标记
D<sub>2</sub>O，重水（D，99.8%）	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-2259	核磁共振样品制备
DSS，2,2-二甲基-2-硅代戊烷-5-磺酸钠-D6（D，98%）	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-8206	核磁共振参考物质
精密5 mm核磁共振管，7&rdquo;长	SJM/Deuterotubes	BOROECO-5-7	核磁共振管
核磁共振波谱仪（14.1 特斯拉）	Bruker		核磁共振数据采集
TCI 5 mm z-PFG 低温探头	Bruker		核磁共振数据采集
软件
Bruker TopSpin 4.0.1	Bruker		核磁共振数据处理