利用噬菌体展示技术筛选高亲和力靶蛋白的蛋白质

摘要

来源：Zhang, W.，等，利用噬菌体展示技术开发靶向E3泛素连接酶的泛素变体调节剂。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示了噬菌体展示技术，用于分离表达对目标蛋白具有高亲和力蛋白的预先改造噬菌体。

方案

1. 准备噬菌体文库

1. 将噬菌体文库置于冰上解冻，并用 PBS 稀释至文库多样性（diversity）的 100 倍。例如，如果文库多样性为 1 × 10¹⁰，文库浓度为 1 × 10¹³，则将文库稀释至浓度为 1 × 10¹²。对于本实验所用的文库，可通过将 1 mL 文库与 9 mL PBS 混合，实现 10 倍稀释。
   注意：文库多样性应在文库构建过程中确定，无法轻易通过其他方法评估。文库浓度可通过将处于对数中期（OD600 0.6 – 0.8）的 E. coli 细胞接种并在 LB/羧苄青霉素培养基上涂布来测定。
2. 加入 1/5 体积的 PEG/NaCl。例如，对于 10 mL 已稀释的文库，加入 2 mL PEG/NaCl。
3. 在冰上孵育 30 分钟。
4. 在 4 °C 下以 11,000 × g 离心 30 分钟，弃去上清液，再离....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Axygen Mini Tube System（0.65 mL，无菌，96/架，每包10架）	Fisher Scientific	14-222-198	塑料器皿
BD Difco 脱水培养基：LB Broth, Miller（Luria-Bertani）	Fisher Scientific	DF0446-17-3	滴定用平板制备
牛血清白蛋白（BSA），第五组分	BioShop Canada	ALB001	缓冲液组分
羧苄青霉素二钠盐，89.0–100.5%，无水	Millipore-Sigma	C1389-5G	噬菌粒感染细胞的培养
紧凑型数字微孔板振荡器	Fisher Scientific	11-676-337	设备
Corning 微孔板铝封膜	Fisher Scientific	07-200-684	噬菌体甘油菌种的封存
脱水琼脂	Fisher Scientific	DF0140-01-0	滴定用平板制备
DS-11 分光光度计/荧光计	DeNovix	DS-11 FX+	设备
Greiner Bio-One CellStar 96孔未经处理U型底微孔板	Fisher Scientific	7000133	塑料器皿
盐酸	Fisher Scientific	A144-500	化学试剂
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R 化学感受态 <em>E. coli</em>	Fisher Scientific	C854003	用于噬菌体感染的细菌菌株
硫酸卡那霉素	Fisher Scientific	AAJ1792406	M13K07辅助噬菌体感染细胞的培养
M13KO7 辅助噬菌体	New England Biolabs	N0315S	介导噬菌粒的包装与分泌
MaxQ 4000 台式轨道摇床	Fisher Scientific	11-676-076	设备
Nunc MaxiSorp 96孔微孔板，平底	Life Technologies	44-2404-21	塑料器皿
磷酸盐缓冲液（PBS）10X 溶液	Fisher Scientific	BP3994	缓冲液组分/噬菌体重悬介质
用于ELISA和孵育的聚酯薄膜	VWR	60941-120	孵育期间覆盖微孔板
聚乙二醇 8000（PEG）	Fisher Scientific	BP233-1	噬菌体沉淀
氯化钠	Millipore-Sigma	S3014	噬菌体沉淀
无菌塑料培养管：半透明聚丙烯	Fisher Scientific	14-956-1D	噬菌体输入样本的培养
盐酸四环素	Fisher Scientific	BP912-100	培养 <em>E. coli</em> OmniMax 细胞
Tris 碱	Fisher Scientific	BP1525	中和洗脱的噬菌体溶液
胰蛋白胨粉末	Fisher Scientific	BP1421-2	细胞生长培养基组分
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	缓冲液组分
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-2	细胞生长培养基组分