利用噬菌体展示技术筛选高亲和力靶蛋白的蛋白质

摘要

来源：Zhang, W.，等，利用噬菌体展示技术开发靶向E3泛素连接酶的泛素变体调节剂。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示了噬菌体展示技术，用于分离表达对目标蛋白具有高亲和力蛋白的预先改造噬菌体。

方案

1. 准备噬菌体文库

1. 将噬菌体文库置于冰上解冻，并用 PBS 稀释至文库多样性（diversity）的 100 倍。例如，如果文库多样性为 1 × 10¹⁰，文库浓度为 1 × 10¹³，则将文库稀释至浓度为 1 × 10¹²。对于本实验所用的文库，可通过将 1 mL 文库与 9 mL PBS 混合，实现 10 倍稀释。
   注意：文库多样性应在文库构建过程中确定，无法轻易通过其他方法评估。文库浓度可通过将处于对数中期（OD600 0.6 – 0.8）的 E. coli 细胞接种并在 LB/羧苄青霉素培养基上涂布来测定。
2. 加入 1/5 体积的 PEG/NaCl。例如，对于 10 mL 已稀释的文库，加入 2 mL PEG/NaCl。
3. 在冰上孵育 30 分钟。
4. 在 4 °C 下以 11,000 × g 离心 30 分钟，弃去上清液，再离心 2 分钟以去除残留的上清液。
   注意：第二次离心时，应将离心管以与第一次相同的朝向放入转子中，以确保沉淀物位于同一位置，从而更易于观察。
5. 每种蛋白使用 1 mL PBT 轻柔重悬噬菌体沉淀。对于四种蛋白，使用 4 mL PBT 重悬沉淀。
   注意：尽量不要触碰沉淀，且避免引入气泡。

2. 将噬菌体展示至目标蛋白

1. 可选对照步骤：向对照板的每个包被孔中加入 100 µL 噬菌体文库。在室温（~20–25 °C）下以 300 rpm 振荡孵育 1 小时，然后将文库从对照板转移至目标板。
2. 移除目标板中的 PB 缓冲液，向每个包被孔中加入 100 µL 噬菌体文库。
3. 在室温（~20–25 °C）下以 300 rpm 振荡孵育 1 小时。

3. 洗脱第一轮噬菌体

1. 移除噬菌体文库，并用 PT 缓冲液洗涤包被的孔四次。将平板倒置并在纸巾上轻拍，以去除最后的液滴。
   注意：如果在一个平板上包被了多种靶蛋白，请尽量减少后续所有溶液在孔之间的流动。
2. 向每个包被孔中加入 100 µL 的 0.1 M HCl，并在室温下以 300 rpm 振荡孵育 5 分钟。
3. 通过向每个包被孔中加入 12.5 µL 的 1 M Tris-HCl（pH 11）来中和 pH。
4. 将来自所有 8 个孔的洗脱噬菌体汇集到一个 1.5 mL 微量离心管中。在转移过程中反复吹打，使溶液均匀，并吸净孔中所有液体。
5. 向汇集的洗脱噬菌体中加入 10% BSA，使其终浓度为 1%。对于典型的首轮洗脱体积 950 µL，加入 95 µL 的 10% BSA。4 °C 保存。此即为第一轮输出产物。

4. 后续筛选轮次的准备工作

1. 按照步骤1.1的方法制备种子培养物，用于培养下一轮筛选所需的噬菌体输入。
2. 按照步骤1.2的方法进行第三轮筛选的包被，但需进行如下修改：
   1. 在96孔结合板中，每种蛋白质仅包被四个孔。使用“第2/3轮”或“第4/5轮”管中一半的内容物用于相应的筛选轮次。根据需要将这些管中的内容物进行稀释，以避免蛋白质从溶液中沉淀析出。
3. 制备下一轮筛选所需的噬菌体输入。
   1. 取第一轮输出物的一半接种于3 mL对数中期细胞中。对于典型的第1轮输出物，可加入500 µL的输出液进行接种。
   2. 在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育30分钟。
   3. 加入M13K07辅助噬菌体，使其终浓度达到1 × 10¹⁰ PFU/mL。
   4. 在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育1小时。
   5. 将全部3 mL培养物转移至30 mL的2YT/carb/kan培养基中，在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Axygen Mini Tube System（0.65 mL，无菌，96/架，每包10架）	Fisher Scientific	14-222-198	塑料器皿
BD Difco 脱水培养基：LB Broth, Miller（Luria-Bertani）	Fisher Scientific	DF0446-17-3	滴定用平板制备
牛血清白蛋白（BSA），第五组分	BioShop Canada	ALB001	缓冲液组分
羧苄青霉素二钠盐，89.0–100.5%，无水	Millipore-Sigma	C1389-5G	噬菌粒感染细胞的培养
紧凑型数字微孔板振荡器	Fisher Scientific	11-676-337	设备
Corning 微孔板铝封膜	Fisher Scientific	07-200-684	噬菌体甘油菌种的封存
脱水琼脂	Fisher Scientific	DF0140-01-0	滴定用平板制备
DS-11 分光光度计/荧光计	DeNovix	DS-11 FX+	设备
Greiner Bio-One CellStar 96孔未经处理U型底微孔板	Fisher Scientific	7000133	塑料器皿
盐酸	Fisher Scientific	A144-500	化学试剂
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R 化学感受态 <em>E. coli</em>	Fisher Scientific	C854003	用于噬菌体感染的细菌菌株
硫酸卡那霉素	Fisher Scientific	AAJ1792406	M13K07辅助噬菌体感染细胞的培养
M13KO7 辅助噬菌体	New England Biolabs	N0315S	介导噬菌粒的包装与分泌
MaxQ 4000 台式轨道摇床	Fisher Scientific	11-676-076	设备
Nunc MaxiSorp 96孔微孔板，平底	Life Technologies	44-2404-21	塑料器皿
磷酸盐缓冲液（PBS）10X 溶液	Fisher Scientific	BP3994	缓冲液组分/噬菌体重悬介质
用于ELISA和孵育的聚酯薄膜	VWR	60941-120	孵育期间覆盖微孔板
聚乙二醇 8000（PEG）	Fisher Scientific	BP233-1	噬菌体沉淀
氯化钠	Millipore-Sigma	S3014	噬菌体沉淀
无菌塑料培养管：半透明聚丙烯	Fisher Scientific	14-956-1D	噬菌体输入样本的培养
盐酸四环素	Fisher Scientific	BP912-100	培养 <em>E. coli</em> OmniMax 细胞
Tris 碱	Fisher Scientific	BP1525	中和洗脱的噬菌体溶液
胰蛋白胨粉末	Fisher Scientific	BP1421-2	细胞生长培养基组分
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	缓冲液组分
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-2	细胞生长培养基组分